白酒是我國(guó)的國(guó)酒，也是世界六大蒸餾酒之一。白酒獨(dú)特風(fēng)味的形成離不開(kāi)其釀造菌群，在發(fā)酵過(guò)程中，復(fù)雜且動(dòng)態(tài)變化的微生物群落在底物轉(zhuǎn)化為各種風(fēng)味物質(zhì)時(shí)起關(guān)鍵作用。微生物群落的演替會(huì)受到初始環(huán)境因素、初始微生物群落和發(fā)酵過(guò)程的影響，其中初始環(huán)境因素（如水分含量、酸度和溫度等）可通過(guò)人為控制。

近年來(lái)研究證實(shí)，通過(guò)優(yōu)化和嚴(yán)格控制溫度可以促進(jìn)或抑制特定微生物類(lèi)群在各種發(fā)酵食品中的生長(zhǎng)。研究表明，通過(guò)合理控制發(fā)酵溫度，可以有效控制和優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程，進(jìn)而提升產(chǎn)品的穩(wěn)定性和質(zhì)量。然而，目前關(guān)于溫度如何影響清香型白酒發(fā)酵過(guò)程中微生物群落以及風(fēng)味物質(zhì)的研究較為有限。

基于1955年山東煙臺(tái)試點(diǎn)總結(jié)出的麩曲白酒“低溫入窖”的經(jīng)典理念，并結(jié)合麩曲清香型白酒的生產(chǎn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)（在生產(chǎn)車(chē)間調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，不同班組工人在入窖酒醅溫度控制上存在差異，分別集中在8 ℃上下和16 ℃上下，且這種差異影響了白酒的品質(zhì)），老年?duì)I養(yǎng)與健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京工商大學(xué)）的肖鵬、高露、李賀賀*等選擇（7.5±1.0）℃和（15.5±1.0）℃作為初始溫度，在生產(chǎn)車(chē)間進(jìn)行麩曲清香型白酒固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，通過(guò)系統(tǒng)探討初始溫度對(duì)發(fā)酵參數(shù)、微生物群落和揮發(fā)性化合物的影響，并闡釋微生物與揮發(fā)性化合物之間的相關(guān)性，旨在為優(yōu)化清香型白酒發(fā)酵工藝和提升產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 理化參數(shù)

在白酒生產(chǎn)過(guò)程中，很難及時(shí)、準(zhǔn)確地獲取酒醅微生物生長(zhǎng)和代謝的相關(guān)信息。因此，技術(shù)人員常通過(guò)測(cè)定理化參數(shù)評(píng)估酒醅的發(fā)酵狀態(tài)和白酒的品質(zhì)。白酒屬于典型的自發(fā)發(fā)酵食品，初始溫度是其關(guān)鍵的工藝參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)立入窖溫度分別為（15.5±1.0）℃和（7.5±1.0）℃的高溫組和低溫組，研究不同初始溫度條件下酒醅發(fā)酵過(guò)程中溫度、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值和酸度的動(dòng)態(tài)變化。如圖1所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，溫度和水分含量先上升后趨于平穩(wěn)。還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，低溫組酒醅還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在第3天略有升高，而后迅速下降。酸度在前15 d無(wú)顯著變化，第21天酸度大幅上升，pH值總體明顯降低?？傊?，酒醅的理化參數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間變化顯著，不同初始溫度下理化參數(shù)變化趨勢(shì)相似，但高溫組酒醅的溫度和酸度顯著高于低溫組（P＜0.05）。

2 微生物多樣性

通過(guò)測(cè)定α多樣性指數(shù)（ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)），可以反映酒醅微生物群落的豐富度和多樣性。細(xì)菌的豐富度和多樣性整體呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)（圖2A、B）。高、低溫組細(xì)菌的多樣性和豐富度分別在第3天和第6天達(dá)到峰值。另一方面，真菌的豐富度和多樣性整體呈現(xiàn)逐步上升的變化趨勢(shì)，但高溫組在第3天迅速升高后又呈下降趨勢(shì)（圖2D、E）。說(shuō)明較高的初始溫度促進(jìn)了微生物在發(fā)酵前3天豐富度和多樣性的增長(zhǎng)。此外，通過(guò)PCoA比較了不同樣品間微生物群落的整體相似性，由圖2C、F可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)細(xì)菌群落和真菌群落都有很大影響。綜上，高、低溫組微生物群落在某些發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)上存在較大差異。

3 微生物組成與演替

細(xì)菌主要?dú)w屬為15 個(gè)屬（相對(duì)豐度＞1%），如圖3A所示，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、鏈球菌屬（Streptococcus）等。發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為L(zhǎng)actobacillus（高溫組48.26%、低溫組41.58%）和Streptococcus（高溫組30.81%、低溫組37.54%）；到發(fā)酵結(jié)束時(shí)，Lactobacillus的相對(duì)豐度升至99.69%（高溫組）和99.08%（低溫組）。已有研究報(bào)道Lactobacillus是清香型白酒酒醅中的優(yōu)勢(shì)菌屬，也是白酒發(fā)酵過(guò)程中微生物演替的生物標(biāo)志物，其相對(duì)豐度呈先上升后趨于平緩。在發(fā)酵第10天，Lactobacillus的相對(duì)豐度在高溫組為94.2%，在低溫組為75.9%，高溫組中，Lactobacillus的生長(zhǎng)速率高于低溫組。

真菌主要?dú)w屬為7 個(gè)屬（相對(duì)豐度＞1%），如圖3B所示，包括酵母菌屬（Saccharomyces）、曲霉菌屬（Aspergillus）、畢赤酵母屬（Pichia）等。發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，優(yōu)勢(shì)真菌屬為Aspergillus（高溫組90.94%、低溫組94.63%）；到發(fā)酵結(jié)束時(shí)，優(yōu)勢(shì)真菌屬轉(zhuǎn)變?yōu)镾accharomyces（高溫組75.51%、低溫組78.91%）。Aspergillus的相對(duì)豐度整體呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別降至17.26%（高溫組）和7.08%（低溫組），這可能與酒醅中氧氣含量減少有關(guān)。Aspergillus可以分泌多種酶，能有效地將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，為其他微生物的生長(zhǎng)提供必需的能量和營(yíng)養(yǎng)。Saccharomyces在發(fā)酵前期迅速繁殖，是白酒釀造中主要的發(fā)酵產(chǎn)酒功能菌。在發(fā)酵第3天，Saccharomyces的相對(duì)豐度在高溫組和低溫組分別為56.86%和32.43%，高溫組中，Saccharomyces的生長(zhǎng)速率高于低溫組。

綜上，白酒在發(fā)酵過(guò)程中存在明顯的微生物演替，在6 d內(nèi)迅速形成了以Lactobacillus和Saccharomyces為主的菌群，不同的初始溫度影響了它們的生長(zhǎng)速度。

4 揮發(fā)性化合物

在酒醅中共鑒定出62 種化合物，包括34 種酯類(lèi)、7 種醇類(lèi)、7 種酸類(lèi)、4 種醛類(lèi)、8 種酚類(lèi)、1 種酮類(lèi)和1 種含硫化合物（圖4A）。酯類(lèi)物質(zhì)在酒醅中相對(duì)含量最高，且種類(lèi)最豐富，這與清香型白酒風(fēng)味成分的特征相一致。高、低溫組酒醅中的揮發(fā)性化合物種類(lèi)一致，但含量上存在差異。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選出的9 種出現(xiàn)頻率較高且具有代表性的香氣描述詞（花香、果香、甜香、醇香、酸香、奶香、糧香、油脂香和糠味）進(jìn)行了感官評(píng)價(jià)。如圖4B所示，高溫組原酒的花香、果香和甜香更為突出，低溫組原酒的油脂香、糠味和糧香較強(qiáng)。為了從分子水平上闡明原酒的感官差異，對(duì)酒樣的揮發(fā)性成分進(jìn)行了定性定量分析，共鑒定出40 種化合物（表1）。不同溫度發(fā)酵的樣品在PCA得分圖中分離明顯（圖4C），表明不同溫度發(fā)酵原酒中揮發(fā)性化合物存在差異。OPLS-DA是一種具有監(jiān)督模式識(shí)別的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，能夠有效地剔除與研究無(wú)關(guān)的影響從而篩選差異代謝物。＝0.994，＝1，Q 2 ＝0.984， R 2 和 Q 2 分別大于0.9和0.5，表明所構(gòu)建的模型擬合效果良好，不同組的樣品發(fā)生明顯的分離（圖4D）。對(duì)模型進(jìn)行200 次置換模擬，結(jié)果如圖4E所示，模型 Q 2 回歸線與 y 軸交于負(fù)半軸，表明模型沒(méi)有發(fā)生過(guò)擬合。進(jìn)一步利用VIP＞1.0和 P ＜0.05標(biāo)準(zhǔn)篩選出了24 種差異化合物（表2）。

判定化合物對(duì)白酒整體香氣的貢獻(xiàn)時(shí)，除了考慮物質(zhì)的含量，還需結(jié)合其閾值和物質(zhì)之間的比例關(guān)系。在清香型白酒中，乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量較高，它們之間的比例對(duì)白酒風(fēng)格有重要影響， 在高溫組和低溫組中，“乙-乳”的比例分別為0.67和0.79，存在一定差異。結(jié)合香氣活度值（odor activity value，OAV）＞1和“乙-乳”比例的重要性，進(jìn)一步確定了12 種重要差異化合物，具體包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、丁酸、正丁醇、3-苯丙酸乙酯、糠醇、戊酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯和異丁醇。在低溫組中，僅癸酸乙酯的含量相對(duì)較高，主要貢獻(xiàn)脂肪香氣。其余11 種化合物則在高溫組中含量較高，酯類(lèi)物質(zhì)（乙酸乙酯、乳酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、戊酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯）多呈果香、花香和甜香；異丁醇具有果香；3-羥基-2-丁酮、糠醇具有甜香；丁酸具有酸味。這些結(jié)果與相應(yīng)的感官評(píng)價(jià)一致。盡管正丁醇具有醇香，但在感官評(píng)價(jià)中未發(fā)現(xiàn)明顯差異，這可能與化合物之間的感知相互作用有關(guān)。

5 微生物群落與理化參數(shù)相關(guān)性

通過(guò)Spearman系數(shù)繪制了相對(duì)豐度前20的微生物屬與理化參數(shù)的相關(guān)性熱圖。如圖5所示，多數(shù)細(xì)菌與還原糖含量、pH值呈顯著正相關(guān)，與溫度、酸度以及水分含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而Lactobacillus與之相反。Lactobacillus為兼性厭氧菌，耐酸性較強(qiáng)。隨著酒醅溫度和酸度的升高及氧氣含量的降低，大部分細(xì)菌的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，而Lactobacillus卻能在這樣的環(huán)境中生長(zhǎng)良好。多數(shù)真菌與溫度和水分含量呈顯著正相關(guān)，與還原糖含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而Aspergillus與之相反。酵母菌（Saccharomyces、Wickerhamomyces、Kazachstania）的生長(zhǎng)溫度較高，同時(shí)它們的生命活動(dòng)會(huì)釋放出大量生物熱，造成酒醅溫度的升高。這些結(jié)果表明，理化參數(shù)對(duì)微生物群落的形成具有很強(qiáng)的選擇性作用。值得注意的是，Lactobacillus和Saccharomyces均與溫度呈高度顯著正相關(guān)，高溫組的發(fā)酵溫度（15～33 ℃）有利于它們的增殖，從而導(dǎo)致了高、低溫組酒醅中微生物屬相對(duì)豐度的不同。

6 微生物群落與揮發(fā)性化合物相關(guān)性

通過(guò)Spearman相關(guān)性分析了發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度前20微生物菌屬與62 種揮發(fā)性化合物之間的關(guān)系，選擇相關(guān)系數(shù)r＞0.7且顯著性P＜0.05構(gòu)建相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)。如圖6所示，9 個(gè)細(xì)菌屬和9 個(gè)真菌屬與51 種風(fēng)味化合物呈顯著正相關(guān)，表明細(xì)菌和真菌群落與風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生密切相關(guān)。其中，Saccharomyces、Kazachstania、Wickerhamomyces和Lactobacillus是關(guān)聯(lián)度較高的微生物，分別與44、33、29 種和42 種揮發(fā)性化合物呈顯著正相關(guān)，表明它們是白酒釀造過(guò)程中重要的風(fēng)味產(chǎn)生微生物。真菌對(duì)酒醅揮發(fā)性化合物物質(zhì)形成的影響大于細(xì)菌。

在真菌中，優(yōu)勢(shì)屬Saccharomyces與多數(shù)揮發(fā)性化合物呈顯著正相關(guān)，除了生產(chǎn)乙醇外，還能代謝產(chǎn)生酯類(lèi)、醇類(lèi)、萜烯類(lèi)和含硫化合物，這與酒醅發(fā)酵過(guò)程中大多數(shù)揮發(fā)性化合物含量逐漸升高相印證（圖4A）。Wickerhamomyces在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中都存在，相對(duì)豐度卻始終低于1%，可以產(chǎn)生各種酯和芳香族化合物，這突顯了它在釀造環(huán)境中的重要功能性作用。Kazachstania能夠代謝產(chǎn)生異戊醇、乙酸異戊酯、糠醇、β-苯乙醇、高級(jí)脂肪酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)。優(yōu)勢(shì)屬Aspergillus是重要的糖化菌，本研究中僅發(fā)現(xiàn)其與糠醛和癸酸呈顯著正相關(guān)。

除了酵母和霉菌外，細(xì)菌在白酒發(fā)酵中的作用和意義越來(lái)越受到重視。大多數(shù)揮發(fā)性化合物與乳酸菌（Lactobacillus、Weissella和Leuconostoc）呈顯著正相關(guān)，因?yàn)槿樗峋梢源x產(chǎn)生乳酸、乙酸和其他有機(jī)酸，這些有機(jī)酸是風(fēng)味物質(zhì)的前體。元轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，Lactobacillus在轉(zhuǎn)錄涉及風(fēng)味化合物及其前體（包括酯類(lèi)）生物合成的基因方面非?；钴S。芽孢桿菌屬（Bacillus）在代謝過(guò)程中能夠產(chǎn)生吡嗪等風(fēng)味物質(zhì)，被認(rèn)為是醬香型白酒生產(chǎn)中的重要功能菌，Bacillus的相對(duì)豐度整體呈下降趨勢(shì)，與糠醛和癸酸含量呈顯著正相關(guān)，這與酒醅發(fā)酵過(guò)程中糠醛和癸酸含量呈下降趨勢(shì)相印證。

為確定導(dǎo)致原酒感官差異的生物學(xué)因素，分析了重要的差異化合物與微生物的相關(guān)性，如表3所示Lactobacillus和Saccharomyces與多數(shù)差異化合物（乙酸乙酯、乳酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、糠醇、癸酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯和異丁醇）呈顯著正相關(guān)。因此，Lactobacillus和Saccharomyces是造成原酒風(fēng)味差異的關(guān)鍵微生物。較高的初始溫度更有利于Lactobacillus和Saccharomyces的生長(zhǎng)（圖3），可以產(chǎn)生更多的酯類(lèi)化合物，有助于促進(jìn)白酒風(fēng)味的形成。總地來(lái)說(shuō)，溫度通過(guò)改變微生物演替速率從而影響代謝產(chǎn)物的形成。

結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)深入探討了不同初始溫度對(duì)清香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的理化參數(shù)、微生物群落及揮發(fā)性化合物的影響，結(jié)果顯示高溫組酒醅的酸度顯著高于低溫組。發(fā)酵溫度與Saccharomyces和Lactobacillus的相對(duì)豐度呈高度顯著正相關(guān)，初始溫度高加速了它們的快速增殖，改變了酒醅的微生物群落結(jié)構(gòu)。在風(fēng)味特征上，高溫組原酒表現(xiàn)出更為濃郁的花果香和甜香，低溫組原酒的油脂香更為突出，篩選出12 種導(dǎo)致原酒感官差異的重要化合物。Saccharomyces、Kazachstania、Wickerhamomyces和Lactobacillus是白酒釀造過(guò)程中重要的風(fēng)味產(chǎn)生微生物，其中Saccharomyces和Lactobacillus是導(dǎo)致原酒風(fēng)味差異的主要生物因素。本研究的結(jié)果揭示了初始溫度對(duì)白酒發(fā)酵過(guò)程的重要作用，可為優(yōu)化白酒固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)提供有價(jià)值的參考。

作者簡(jiǎn)介

通信作者

李賀賀，博士生導(dǎo)師，北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院釀酒工程系副研究員。國(guó)家級(jí)白酒評(píng)酒委員。全國(guó)白酒標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)委員、中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)食品風(fēng)味專(zhuān)業(yè)委員會(huì)委員、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)同創(chuàng)新平臺(tái)感官質(zhì)量與消費(fèi)洞察標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)專(zhuān)家委員會(huì)委員。致力于酒類(lèi)風(fēng)味化學(xué)、白酒真實(shí)性溯源、釀造微生物等方面研究。

入選中國(guó)科協(xié)“青年托舉人才工程”；主持3項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金，企業(yè)產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目7項(xiàng)。以第一作者或通訊作者發(fā)表學(xué)術(shù)論文60余篇，高被引論文7篇；授權(quán)發(fā)明專(zhuān)利14項(xiàng)；參與制訂國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)2項(xiàng)。以第一完成人獲中國(guó)商業(yè)聯(lián)合會(huì)科技技術(shù)獎(jiǎng)特等獎(jiǎng)1項(xiàng)、中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)科技創(chuàng)新獎(jiǎng)-優(yōu)秀論文二等獎(jiǎng)1項(xiàng)；以主要完成人獲神農(nóng)中華農(nóng)業(yè)科技獎(jiǎng)科學(xué)科普獎(jiǎng)、中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)科技創(chuàng)新技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)、中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)自然科學(xué)獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)、全國(guó)商業(yè)科技進(jìn)步獎(jiǎng)特等獎(jiǎng)及中輕聯(lián)科技進(jìn)步獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)5項(xiàng)。多篇論文獲得“T5000中國(guó)精品科技期刊頂尖學(xué)術(shù)論文”、“中國(guó)酒業(yè)協(xié)會(huì)科學(xué)進(jìn)步優(yōu)秀論文獎(jiǎng)”、“最具影響力學(xué)術(shù)論文”等。

第一作者

肖鵬， 男，北京工商大學(xué)2022級(jí)碩士研究生，研究方向?yàn)榘拙骑L(fēng)味化學(xué)及釀造微生物開(kāi)發(fā)與利用。主持了北京工商大學(xué)研究生科研能力提升計(jì)劃項(xiàng)目1項(xiàng)，參與了“十四五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃1項(xiàng)，國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目1項(xiàng)，以及企業(yè)橫向課題1項(xiàng)。

本文《溫度對(duì)清香型白酒發(fā)酵過(guò)程中微生物群落及風(fēng)味物質(zhì)的影響》來(lái)源于《食品科學(xué)》2025年46卷第14期16-24頁(yè)，作者： 肖鵬 ，高露 ，李有明 ，李賀賀 ，王柏文 ，劉夢(mèng)瑤 ，孫寶國(guó) ，李慧峰 。 DOI:10.7506 / spkx1002-6630-20241230-260。點(diǎn)擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：欒文莉；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來(lái)源于文章原文及攝圖網(wǎng)

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