內(nèi)毒素檢測在現(xiàn)代生物制品和醫(yī)藥領(lǐng)域中扮演著至關(guān)重要的角色，注射類藥物、注射器具，植入醫(yī)療器械等都有相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，用以確保產(chǎn)品安全性。然而，在進行內(nèi)毒素檢測的過程中，許多實驗室和研究人員可能會面臨一系列挑戰(zhàn)和疑惑。

其中低內(nèi)毒素回收（LER）一直是備受關(guān)注的熱門話題，以下十個有關(guān)低內(nèi)毒素回收的問題你了解嗎？內(nèi)毒素檢測專家Lonza為你解答。

Q1：為何LER對生物制品生產(chǎn)非常重要？

法規(guī)要求生物制品需要通過兔熱原實驗檢測熱原含量以確保產(chǎn)品的安全性。如果能夠證明細菌內(nèi)毒素測試于兔熱原等效，則可使用細菌內(nèi)毒素測試代替兔熱原進行檢測。需要注意的是，某些生物制品使用內(nèi)毒素檢查法檢測時會存在LER效應(yīng)，生產(chǎn)廠家需要使用兔熱原進行檢測。

為了確認LER是否和體內(nèi)的非內(nèi)毒素?zé)嵩粯赢a(chǎn)生致熱反應(yīng)，法規(guī)要求生物制品制造廠家進行加標(biāo)（Hold-time）研究，并且，相同時間點也需要進行兔熱原檢測。

Q2：FDA對LER持什么樣的態(tài)度？

LER主要于生物制品有關(guān)，主要是與單克隆抗體及一些治療用融合抗體。加標(biāo)（Hold-time）研究表明LER不僅僅受到賦性劑的影響，蛋白濃度、內(nèi)毒素檢測方法、檢測試劑的供應(yīng)商、Hold-time研究所用溫度及時間都是影響LER的主要因素。此外，角標(biāo)內(nèi)毒素的種類（RSE, CSE，NOE）也會影響最終結(jié)果。

Q3：怎樣進行Hold-time研究？

①向未稀釋樣品中加入一定濃度的內(nèi)毒素(加標(biāo)內(nèi)毒素濃度≤樣品釋放限值)

②根據(jù)測試樣品信息確定hold-time研究參數(shù)（溫度，容器類型，考察時間點）

③在特定的時間點進行內(nèi)毒素檢測（例如：4小時，24小時，72小時，5天，7天）

④計算回收率

Q4：FDA對于Hold-time研究有哪些建議？

FDA對于Hold-time研究的建議總結(jié)如下：

①至少進行3批產(chǎn)品的驗證

②添加內(nèi)毒素濃度≤樣品的釋放限值

③對于產(chǎn)品的研究至少8天

④使用工作標(biāo)準(zhǔn)品作為最差條件進行研究

Q5：天然來源內(nèi)毒素（Naturally Occurring Endotoxin，NOE）和標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的區(qū)別？

天然來源的內(nèi)毒素（NOE）是從革蘭氏陰性菌中粗提出來的內(nèi)毒素。與RSE或者CSE不同，天然來源的內(nèi)毒素（NOE）是不經(jīng)過純化的內(nèi)毒素。與RSE或者CSE 相比,NOE不容易導(dǎo)致LER，這可能與NOE為非精制提純內(nèi)毒素，含有蛋白質(zhì)和細胞碎片物有關(guān)。

Q6：與RSE或者CSE相比，使用NOE進行研究是否有優(yōu)勢？

從提交給FDA的幾個BLA匯編數(shù)據(jù)來看（見表一），不論內(nèi)毒素來源如何，即不論使用CSE或者是NOE，細菌內(nèi)毒素測試和兔熱原檢測結(jié)果都存在沖突。這些數(shù)據(jù)從另外一方面表明，即使使用內(nèi)毒素檢測產(chǎn)生了LER現(xiàn)象，兔熱原檢測依然能夠檢測樣品是否會引起熱原反應(yīng)。這個因為這個原因，FDA不支持或不鼓勵在Hold-time研究中使用NOE。此外，每種NOE從不同的菌種中制備并且菌種也會受到不同生長條件影響。所以，如果沒有NOE的標(biāo)準(zhǔn)化制備流程，監(jiān)管機構(gòu)無法判斷NOE是否能夠有效代替標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素。

表一：提交給FDA的BLA數(shù)據(jù)摘要

目前有一些研究學(xué)者在Hold-time研究中使用了NOE，并且獲得了較好的結(jié)果。并且結(jié)果發(fā)表于2015年9月的美國藥典論壇，該論文的主要觀點為與標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素相比NOE更加穩(wěn)定并且引起LER的可能性更小。

然而，也有研究學(xué)者對此持反對意見。因為實驗結(jié)果表明，某些未稀釋樣品中添加的NOE或者CSE/RSE 不能回收回來。因此，關(guān)于NOE能夠成功解決LER問題仍然未有定論。

Q7：是否可以使用分散劑解決LER問題？

有一些樣品能夠使用分散劑，例如PyroSperse?來解決LER問題。然而，由于每個樣品出現(xiàn)LER問題的原因都不盡相同，所以分散劑并不能解決所有問題。當(dāng)出現(xiàn)LER問題時可以先使用分散劑如PyroSperse?來進行摸索研究，如果分散劑不能解決問題，則需要探究其他樣品前處理方式。

Q8：解決LER問題的樣品前處理方式有哪些？

解決LER問題的主要思路為去除遮蔽現(xiàn)象。主要處理方式包括：

①調(diào)節(jié)pH，影響氫鍵

②添加Mg2+/Ca2+，防止螯合劑螯合內(nèi)毒素聚合物中的二價離子

③使用分散劑PyroSperse?，干擾內(nèi)毒素聚集

Q9：LER是否有潛在公共安全性問題？

FDA對于LER及其與藥物安全性的相關(guān)性問題持保守謹(jǐn)慎態(tài)度。盡管目前沒有報道表明LER有公共安全問題，但是FDA擔(dān)心某些藥物會因為LER問題不能通過USP<85>檢出內(nèi)毒素，從而引起人體熱原反應(yīng)。

Q10：有哪些組織正在幫助醫(yī)藥生產(chǎn)商研究LER問題？

PDA（Parenteral Drug Association）以及BPOG（Biophorum Operations Group）均成立LER研究工作組，用于研究LER的影響以及解決LER問題的方案。試劑供應(yīng)商、內(nèi)毒素檢測終端用戶與全球監(jiān)管機構(gòu)緊密合作，共同調(diào)查并給出受LER影響的產(chǎn)品的建議。

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