做顯微成像是不是有過這樣的崩潰經(jīng)歷：想要觀察神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)，厚樣品一上鏡，組織邊緣立刻冒出一圈「佛光」，整幅畫面一片亮霧；切成微分干涉，塑料皿一放進光路就偏振翻車，圖像拉絲到懷疑人生……

方法沒選對，再用心苦干也是白搭。不同的成像方法原理不同，適用的場景也不同。我們把相襯、微分干涉、調(diào)制對比、漸變對比四種熱門成像方法拉進同一張表：誰能和塑料皿和平共處？誰能在厚樣品里留住細(xì)節(jié)？誰最省預(yù)算最好上手？一目了然，讓你少走彎路，直接把細(xì)胞拍成大片。

表 1. 觀察方法的比較

除此之外，我們還整理了共聚焦顯微鏡在深層組織、腦組織、神經(jīng)血管觀察成像的實戰(zhàn)案例，從操作應(yīng)用到成像分析一網(wǎng)打盡，更有頂刊前沿文獻匯總，打開思路上高分！現(xiàn)在掃碼即可免費領(lǐng)取丁香實驗聯(lián)合奧偉登（Evident）定制的「神經(jīng)生物學(xué)顯微成像實操手冊」實體手冊，限量200本。還將隨機抽取5位幸運用戶，送出品牌定制顯微鏡模型。機不可失，立即參與吧～

手冊內(nèi)容搶先看：

相襯方法的變化

圖 1 通過相應(yīng)的光學(xué)元件排列簡要說明了無需染色即可觀察透明物體的常見相位可視化方法。傳統(tǒng)的相位可視化方法通過在聚光鏡光瞳和物鏡光瞳中分別放置特定光學(xué)元件來實現(xiàn)。

圖 1. 各種相位可視化方法的光路布置。

各種相位可視化方法的必要光學(xué)元件。a. 相襯方法；b. 微分干涉方法；c. 調(diào)制對比方法；d. 漸變對比方法。

相襯方法（圖 1a）組合使用帶環(huán)狀孔徑的專用聚光器透鏡和含有相位膜環(huán)的專用物鏡透鏡。在通過聚光鏡環(huán)狀孔徑的光線中，那些直接通過樣品的光線會通過物鏡光瞳的相位膜。另一方面，被樣品偏轉(zhuǎn)的光線在相位膜外通過，從而在兩個分量相互干擾的點產(chǎn)生明暗對比。這一過程的典型特征是，在樣品的折射率分布發(fā)生變化的梯度處會出現(xiàn)光暈現(xiàn)象。厚樣品不適合采用這種方法，因為會出現(xiàn)過強的光暈。

微分干涉方法（圖 1b）是一種偏振剪切干涉儀，在聚光鏡光瞳和物鏡光瞳位置裝有互補的沃拉斯頓棱鏡。樣品圖像變?yōu)樵诠潭ǚ较蛏下晕⑵频闹叵瘢⑶覙悠返恼凵渎侍荻葞в嘘幱?，使其看起來具有三維立體感。由于采用了偏光干涉，如果有塑料皮氏培養(yǎng)皿或其它物體在光路中造成偏振失真，則無法進行觀察。

調(diào)制對比方法（圖 1c）利用聚光鏡光瞳的狹縫開口將照明光束限制在一個方向。引導(dǎo)光束會使樣品中光的直線部分呈現(xiàn)灰色，而由于物鏡光瞳的調(diào)制器，折射部分的對比度將根據(jù)折射方向而變化。通過透射或屏蔽部分光，可以獲得類似于微分干涉圖像的三維圖像。由于調(diào)制對比方法中不使用偏光，可以使用皮氏培養(yǎng)皿之類的塑料容器。但使用這種方法時分辨率略有下降，因為限制照明光束的方向意味著照明數(shù)值孔徑（NA）較小。

寶典中還詳細(xì)介紹了漸變對比方法的原理、漸變對比方法的特性以及配制方法，手把手教你拍出好圖，還有透明化標(biāo)本的深層組織觀察應(yīng)用、四重免疫熒光應(yīng)用等實戰(zhàn)詳解，小伙伴們抓緊領(lǐng)取手冊，快速上手，拿下熒光結(jié)果吧！

內(nèi)容策劃：潘成

內(nèi)容審核：朱卿

題圖來源：奧偉登（Evident）