摘要：在生物制藥領(lǐng)域，治療性單克隆抗體（mAb）的生產(chǎn)技術(shù)不斷革新。傳統(tǒng)流加培養(yǎng)（fed-batch）雖仍是主流生產(chǎn)工藝，但灌注培養(yǎng)（perfusion）等強化生產(chǎn)工藝因能持續(xù)收獲產(chǎn)物、減少產(chǎn)物降解等優(yōu)勢，逐漸受到行業(yè)關(guān)注。然而，目前多數(shù)用于灌注工藝的細胞系仍是通過傳統(tǒng)流加培養(yǎng)細胞系開發(fā)（CLD）流程獲得后再進行適應(yīng)性改造，這種方式存在明顯不足。 本研究通過設(shè)計兩種不同的細胞系開發(fā)流程 —— 傳統(tǒng)流加培養(yǎng) CLD 流程與新型灌注培養(yǎng) CLD 流程，以中國倉鼠卵巢（CHO）細胞為研究對象，系統(tǒng)對比了兩種流程開發(fā)的細胞系在流加培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)工藝中的性能。結(jié)果表明，灌注培養(yǎng) CLD 流程通過采用灌注專用培養(yǎng)基、更精準模擬灌注工藝的縮小模型以及灌注特異性篩選標準，開發(fā)出的細胞系在灌注培養(yǎng)中表現(xiàn)出更高的比生產(chǎn)力（qP）、體積生產(chǎn)力（VolP）和細胞穩(wěn)定性，總蛋白產(chǎn)量提升 16%，且產(chǎn)物質(zhì)量屬性（如糖基化、電荷變異）無顯著差異。該研究為生物制藥行業(yè)優(yōu)化細胞系開發(fā)、推動強化生產(chǎn)工藝應(yīng)用提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐，有望降低生物制藥成本，讓更多患者獲得可負擔的治療藥物。

1、引言：生物制藥生產(chǎn)工藝的演進與細胞系開發(fā)的挑戰(zhàn) 1.1 治療性單克隆抗體制備技術(shù)的發(fā)展歷程

自 1986 年首個治療性單克隆抗體（mAb）OKT3 通過小鼠腹水法生產(chǎn)并獲美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準以來，生物制藥行業(yè)經(jīng)歷了翻天覆地的變革。隨著現(xiàn)代重組 DNA 技術(shù)的發(fā)展與簡化，如今超過半數(shù)的獲批生物制劑依賴永生化哺乳動物細胞系生產(chǎn)，其中中國倉鼠卵巢（CHO）細胞憑借其高表達能力、良好的產(chǎn)物質(zhì)量控制及安全性，成為應(yīng)用最廣泛的宿主細胞（圖 1 為細胞系開發(fā)流程概覽，包含流加培養(yǎng)與灌注培養(yǎng) CLD 流程的關(guān)鍵階段）。

早期重組細胞培養(yǎng)系統(tǒng)面臨諸多挑戰(zhàn)，抗體表達水平通常低于 1g/L，為滿足生產(chǎn)需求，企業(yè)不得不建設(shè)可容納 10,000L 以上生物反應(yīng)器的生產(chǎn)設(shè)施。過去數(shù)十年間，生物制造領(lǐng)域在硬件（如生物反應(yīng)器設(shè)計）、軟件（如工藝控制算法）方面持續(xù)改進，建立了穩(wěn)健的模板化工藝，只需對不同單克隆抗體生產(chǎn)工藝進行細微調(diào)整，即可實現(xiàn)生產(chǎn)效率最大化。

1.2 主流生產(chǎn)工藝：流加培養(yǎng)的優(yōu)勢與局限

目前，流加培養(yǎng)（fed-batch） 是生物制藥行業(yè)最主流的生產(chǎn)工藝，其核心優(yōu)勢在于工藝簡單、適配現(xiàn)有生產(chǎn)設(shè)施架構(gòu)，且能實現(xiàn)較高的體積生產(chǎn)力（VolP）。流加培養(yǎng)的基本流程為：細胞在支持對數(shù)生長期的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨后通過優(yōu)化的批量補料策略添加濃縮補料液，在支持細胞生長的同時最大化單克隆抗體產(chǎn)量。

然而，流加培養(yǎng)存在顯著局限：整個工藝周期（通常超過 14 天）內(nèi)，所有細胞培養(yǎng)成分均留在生物反應(yīng)器中，導致單克隆抗體、活細胞不斷積累的同時，死細胞、細胞碎片、泄漏的胞內(nèi)蛋白及毒性副產(chǎn)物也隨之增加。這些物質(zhì)會抑制細胞生長、降低抗體產(chǎn)量，并對產(chǎn)物質(zhì)量產(chǎn)生負面影響。隨著治療性抗體形式日益復雜（如雙特異性抗體），流加培養(yǎng)的上述問題將更為突出。

1.3 新興趨勢：灌注培養(yǎng)的優(yōu)勢與細胞系開發(fā)的痛點

近年來，行業(yè)開始積極探索灌注培養(yǎng)（perfusion） 等強化生產(chǎn)工藝的潛力。與流加培養(yǎng)通過定時補料解決培養(yǎng)基營養(yǎng)不足不同，灌注培養(yǎng)通過持續(xù)輸入新鮮培養(yǎng)基、同時移除含產(chǎn)物的廢培養(yǎng)基（即產(chǎn)物收獲），實現(xiàn)高活細胞密度（VCD）和長時間細胞活力維持。這種工藝有兩大核心優(yōu)勢：一是縮短藥物產(chǎn)物暴露于蛋白水解酶和氧化還原蛋白的時間，減少產(chǎn)物降解與變性；二是便于實現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)，有望縮小生產(chǎn)設(shè)施規(guī)模，降低制造成本。

盡管灌注培養(yǎng)優(yōu)勢顯著，但細胞系開發(fā)（CLD）流程的優(yōu)化卻未跟上工藝革新的步伐。目前行業(yè)普遍做法是將為流加培養(yǎng)開發(fā)的細胞系直接改造用于灌注培養(yǎng)，忽視了兩種工藝對細胞特性的不同需求：流加培養(yǎng)需細胞具備高體積生產(chǎn)力（通常由高細胞密度驅(qū)動），而灌注培養(yǎng)則更需要細胞具備高比生產(chǎn)力（qP）和適度生長速率。這種 “復用” 細胞系的做法，可能導致灌注培養(yǎng)工藝效率低下。因此，本研究旨在探索通過優(yōu)化 CLD 流程，開發(fā)更適配灌注培養(yǎng)的細胞系。

二、研究方法：兩種細胞系開發(fā)流程的設(shè)計與實施

本研究以CHOZN? GS?/?細胞為宿主細胞，通過設(shè)計 “流加培養(yǎng) CLD 流程” 與 “灌注培養(yǎng) CLD 流程”，系統(tǒng)對比兩種流程開發(fā)的細胞系在不同工藝中的性能。研究分為四個核心階段：迷你池（minipool）構(gòu)建與篩選、單細胞克隆、生物反應(yīng)器評估及克隆穩(wěn)定性檢測，具體方法如下。

2.1 轉(zhuǎn)染與迷你池篩選 2.1.1 細胞轉(zhuǎn)染與篩選

將含谷氨酰胺合成酶（GS）、IgG1 重鏈和輕鏈編碼序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 CHOZN? GS?/?細胞。轉(zhuǎn)染后，通過離心去除含谷氨酰胺的培養(yǎng)基，將細胞重懸于無谷氨酰胺培養(yǎng)基中，以 5000 個細胞 / 孔的密度接種到 96 孔板進行迷你池篩選（依賴 GS 基因?qū)崿F(xiàn)篩選壓力）。24 天后，92% 的孔中觀察到細胞生長（共接種 560 個迷你池）。

2.1.2 7 天靜態(tài) assay 與迷你池初篩

將生長良好的迷你池傳代至兩個 96 孔板，一個用于細胞擴增，另一個進行 7 天靜態(tài) assay（評估生產(chǎn)力的首次篩選）。結(jié)果顯示，有細胞生長的孔中，體積生產(chǎn)力（VolP）范圍為 0.1-72.9μg/mL（補充圖 1），選取 VolP≥9.1μg/mL 的前 40 個迷你池進行后續(xù)實驗。

2.2 兩種 CLD 流程的核心差異

研究設(shè)計的兩種 CLD 流程在培養(yǎng)基選擇、縮小模型（scale-down model） 和篩選標準上存在關(guān)鍵差異，具體如下表所示：

2.3 迷你池的批量、流加與半灌注 assay

將前 40 個迷你池分為兩組，分別采用兩種流程的培養(yǎng)基和 assay 進行評估：

流加培養(yǎng)組：使用流加專用培養(yǎng)基，在 TubeSpin? 生物反應(yīng)器管中進行 14 天流加培養(yǎng) assay，補料采用 EX-CELL? Advanced CHO Feed 1 與 Cellvento? 4Feed 的混合液，監(jiān)測細胞活力、VCD、VolP 等指標。

灌注培養(yǎng)組：使用灌注專用培養(yǎng)基，在 24 深孔板中進行 5 天半灌注 assay（每日培養(yǎng)基交換率 0.5 vessel volume/day，VVD），除監(jiān)測活力、VCD、VolP 外，重點評估比生產(chǎn)力（qP）—— 該指標能消除細胞密度和培養(yǎng)基交換率差異，更準確反映灌注工藝中細胞的生產(chǎn)力。

2.4 單細胞克隆與克隆篩選

從兩種流程的迷你池篩選中，各選取前 5 個表現(xiàn)最優(yōu)的迷你池進行單細胞克?。ㄍㄟ^ SONY FX500 流式細胞分選儀實現(xiàn)單克隆化）?？寺∩L至 80% 匯合度后，進行 7 天靜態(tài) assay，分別選取流加培養(yǎng)組前 80 個克隆、灌注培養(yǎng)組前 160 個克隆進行后續(xù)放大篩選（部分克隆因無法適應(yīng)放大培養(yǎng)被淘汰，最終流加組 77 個、灌注組 152 個克隆進入下一步）。

2.5 生物反應(yīng)器評估與穩(wěn)定性檢測

縮小模型驗證：將篩選出的克隆分別在 96 深孔板流加 assay 和半灌注 assay 中驗證性能，選取前 20 個克隆進行放大。

微生物反應(yīng)器與 3L 生物反應(yīng)器驗證：使用 Mobius? breez 微生物反應(yīng)器（1VVD 灌注速率）和 3L 玻璃生物反應(yīng)器，對比兩種流程開發(fā)的克隆在灌注工藝中的性能（包括 VCD、VolP、qP、產(chǎn)物質(zhì)量）。

穩(wěn)定性檢測：將克隆連續(xù)傳代 20 代（約 60 個群體倍增數(shù)），通過對比傳代前（P0）和傳代后（P20）在半灌注 assay 中的 VCD、VolP、qP，評估克隆穩(wěn)定性（偏差≤20% 視為穩(wěn)定）。

三、研究結(jié)果：灌注培養(yǎng) CLD 流程顯著提升細胞系性能 3.1 迷你池階段：培養(yǎng)基與 assay 類型影響迷你池篩選結(jié)果 3.1.1 細胞生長與生產(chǎn)力差異

前 40 個迷你池在兩種培養(yǎng)基中的批量 assay 結(jié)果顯示（圖 2）：

細胞活力：所有迷你池在 7 天培養(yǎng)中均保持≥85% 的活力（圖 2a）。

活細胞密度（VCD）：流加專用培養(yǎng)基中迷你池的平均峰值 VCD（12.2×10?活細胞 /mL）顯著高于灌注專用培養(yǎng)基（10.5×10?活細胞 /mL）（圖 2b）。

細胞直徑：灌注專用培養(yǎng)基中細胞平均直徑（14.5±0.5μm）顯著大于流加專用培養(yǎng)基（13.9±0.4μm）（圖 2c）。

體積生產(chǎn)力（VolP）：整體迷你池的平均 VolP 在兩種培養(yǎng)基中無統(tǒng)計學差異（流加組 166±188μg/mL vs 灌注組 106±134μg/mL），但前 10 個高生產(chǎn)力迷你池的 VolP 存在顯著差異（流加組 452±107μg/mL vs 灌注組 307±113μg/mL）（圖 2d）。

3.1.2 迷你池排名差異：培養(yǎng)基選擇影響篩選結(jié)果

兩種培養(yǎng)基中迷你池的生產(chǎn)力排名存在顯著差異（圖 2e）：若基于流加培養(yǎng)基篩選灌注工藝用迷你池，會遺漏 2 個灌注培養(yǎng)基中排名前 5 的迷你池；反之，基于灌注培養(yǎng)基篩選流加工藝用迷你池，也會導致流加培養(yǎng)基中排名第 4、5 的迷你池被排除。這表明，在 CLD 流程早期選擇與目標工藝匹配的培養(yǎng)基和 assay 至關(guān)重要。

圖 2：前 40 個迷你池在兩種培養(yǎng)基中的批量 assay 結(jié)果（來源：原文 Figure 2）
（a）細胞活力變化；（b）活細胞密度（VCD）變化；（c）細胞直徑對比；（d）體積生產(chǎn)力（VolP）對比；（e）迷你池生產(chǎn)力排名對比

3.2 迷你池的流加與半灌注 assay 結(jié)果 3.2.1 流加 assay 表現(xiàn)

前 24 個迷你池在流加 assay 中（14 天培養(yǎng)）：

除 1 個迷你池外，其余均保持≥75% 活力；

平均峰值 VCD 為 19.6±3.3×10?活細胞 /mL（范圍 13.4-25.2×10?活細胞 /mL）；

平均峰值 VolP 為 1206±942μg/mL（范圍 27-3213μg/mL），前 5 個迷你池（MP36、MP22、MP34、MP27、MP24）的 VolP 均超過 2000μg/mL（圖 3a、b）。

3.2.2 半灌注 assay 表現(xiàn)

同一批迷你池在半灌注 assay 中（5 天培養(yǎng)）：

所有迷你池保持≥84% 活力，僅 4 個迷你池活力低于 90%；

平均峰值 VCD 達 46.2±7.8×10?活細胞 /mL（范圍 28.9-63.2×10?活細胞 /mL），顯著高于流加 assay，這得益于新鮮培養(yǎng)基的持續(xù)補充；

平均峰值 VolP 為 658±561μg/mL（范圍 14-1929μg/mL），前 5 個迷你池（MP22、MP34、MP25、MP24、MP36）的 VolP 均超過 1261μg/mL；

平均峰值比生產(chǎn)力（qP）為 11.6±9.8pg?cell?1?day?1（范圍 0.3-33.3pg?cell?1?day?1），前 5 個迷你池的 qP 均超過 21.6pg?cell?1?day?1（圖 3c、d、e）。

3.2.3 關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：篩選指標影響迷你池選擇

半灌注 assay 中，基于 VolP 和 qP 的迷你池排名存在差異（圖 3f）：若基于流加 assay 的 VolP 選擇迷你池（如 MP36、MP22、MP34），會遺漏半灌注 assay 中 qP 最高的迷你池 MP25。這進一步證明，灌注工藝需以 qP 為核心篩選指標，而非僅依賴 VolP。

圖 3：前 24 個迷你池在流加 assay 和半灌注 assay 中的表現(xiàn)（來源：原文 Figure 3）
（a）流加 assay 中細胞活力與 VCD 變化；（b）流加 assay 中迷你池 VolP 排名；（c）半灌注 assay 中細胞活力與 VCD 變化；（d）半灌注 assay 中迷你池 VolP 排名；（e）半灌注 assay 中迷你池 qP 排名；（f）兩種 assay 中迷你池排名對比

3.3 克隆階段：灌注培養(yǎng) CLD 流程開發(fā)的克隆性能更優(yōu) 3.3.1 克隆的流加與半灌注 assay 表現(xiàn)

流加培養(yǎng)組克隆：77 個克隆在 96 深孔板流加 assay 中（7 天培養(yǎng)），除 3 個克隆外均保持≥70% 活力；平均峰值 VCD 為 15.0±6.9×10?活細胞 /mL（范圍 3.4-32.3×10?活細胞 /mL）；平均 VolP 為 722±283μg/mL（范圍 180-1408μg/mL），前 15 個克隆的 VolP 均超過 949μg/mL（圖 4a、b、c）。

灌注培養(yǎng)組克隆：152 個克隆在 96 深孔板半灌注 assay 中（5 天培養(yǎng)），137 個克隆保持≥70% 活力；平均峰值 VCD 為 40.1±23.2×10?活細胞 /mL（范圍 2.9-119.4×10?活細胞 /mL）；平均 VolP 為 1075.3±594.4μg/mL（范圍 26.6-2373.5μg/mL）；平均 qP 為 21.8±10.3pg?cell?1?day?1（范圍 5.2-76.9pg?cell?1?day?1），選取 qP≥30pg?cell?1?day?1 的前 20 個克隆進行后續(xù)驗證（表 1 為前 20 個克隆的詳細性能數(shù)據(jù)）（圖 4d、e、f）。

圖 4：兩種 CLD 流程開發(fā)的克隆在縮小模型中的表現(xiàn)
（a）流加培養(yǎng)組克隆在流加 assay 中的活力分布；（b）流加培養(yǎng)組克隆的 VCD 分布；（c）流加培養(yǎng)組克隆的 VolP 排名；（d）灌注培養(yǎng)組克隆在半灌注 assay 中的活力分布；（e）灌注培養(yǎng)組克隆的 VCD 分布；（f）灌注培養(yǎng)組克隆的 VolP 排名

表 1：灌注培養(yǎng)組克隆在半灌注 assay 中按 qP 排名的前 20 個克隆性能

3.3.2 兩種流程克隆在流加培養(yǎng)中的性能對比

選取流加培養(yǎng) CLD 流程的 11 個最優(yōu)克隆與灌注培養(yǎng) CLD 流程的 10 個最優(yōu)克隆，在 TubeSpin? 生物反應(yīng)器管中進行流加培養(yǎng) assay 對比（圖 5）：

細胞活力：除各 1 個克隆外，其余克隆均保持≥90% 活力，兩組克隆的日均活力無顯著差異（圖 5a）。

活細胞密度（VCD）：流加培養(yǎng)組克隆的平均峰值 VCD（20.2±4.7×10?活細胞 /mL）顯著高于灌注培養(yǎng)組（13.8±4.8×10?活細胞 /mL），且從培養(yǎng)第 3 天起差異即有統(tǒng)計學意義（圖 5b）。

體積生產(chǎn)力（VolP）：兩組克隆的平均峰值 VolP 無顯著差異（流加組 2822±380μg/mL vs 灌注組 2989±543μg/mL）（圖 5c）。

比生產(chǎn)力（qP）：灌注培養(yǎng)組克隆的平均 qP（31.3±11.8pg?cell?1?day?1）顯著高于流加培養(yǎng)組（18.7±8.3pg?cell?1?day?1）（圖 5d）。

總蛋白產(chǎn)量：盡管 VCD 和 qP 存在差異，但兩組克隆的總蛋白產(chǎn)量無顯著差異（流加組 84.7±11.4mg vs 灌注組 89.7±15.8mg），表明流加培養(yǎng)組通過 “更多細胞 + 較低單細生產(chǎn)能力” 實現(xiàn)產(chǎn)量，而灌注培養(yǎng)組通過 “較少細胞 + 較高單細生產(chǎn)能力” 達成同等產(chǎn)量。

圖 5：兩種 CLD 流程克隆在流加培養(yǎng) assay 中的性能對比（來源：原文 Figure 5）
（a）兩組克隆的日均活力；（b）兩組克隆的峰值 VCD；（c）兩組克隆的峰值 VolP；（d）兩組克隆的 qP

3.3.3 兩種流程克隆在灌注培養(yǎng)中的性能對比

將上述 21 個克隆在 24 深孔板半灌注 assay 中進一步對比（圖 6）：

細胞活力：除各 1 個克隆外，其余克隆均保持≥90% 活力，兩組日均活力無顯著差異（圖 6a）。

活細胞密度（VCD）：流加培養(yǎng)組克隆的平均峰值 VCD（52.3±11.6×10?活細胞 /mL）仍顯著高于灌注培養(yǎng)組（37.6±7.7×10?活細胞 /mL），差異從培養(yǎng)第 3 天起顯現(xiàn)（圖 6a）。

體積生產(chǎn)力（VolP）：灌注培養(yǎng)組克隆的平均峰值 VolP（1961±74μg/mL）顯著高于流加培養(yǎng)組（1777±97μg/mL），差異具有統(tǒng)計學意義（圖 6b）。

比生產(chǎn)力（qP）：灌注培養(yǎng)組克隆的平均 qP（44.7±6.6pg?cell?1?day?1）顯著高于流加培養(yǎng)組（31.7±8.6pg?cell?1?day?1）（圖 6c）。

總蛋白產(chǎn)量：得益于更高的 VolP 和 qP，灌注培養(yǎng)組克隆的總蛋白產(chǎn)量（12.0±0.9mg）較流加培養(yǎng)組（10.4±0.7mg）提升 16%，且差異具有統(tǒng)計學意義（圖 6d）。

3.3.4 產(chǎn)物質(zhì)量與基因穩(wěn)定性驗證

產(chǎn)物質(zhì)量屬性（PQAs）：兩組克隆的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（糖基化、電荷變異）均在 IgG1 分子的標準范圍內(nèi)，且可通過工藝或培養(yǎng)基調(diào)整進一步優(yōu)化。

基因穩(wěn)定性：RNA 測序結(jié)果顯示，兩種 CLD 流程開發(fā)的克隆在重鏈和輕鏈 mRNA 轉(zhuǎn)錄本中的突變率無顯著差異，表明克隆的序列變異主要源于克隆本身的異質(zhì)性，而非 CLD 流程。

圖 6：兩種 CLD 流程克隆在半灌注 assay 中的性能對比（來源：原文 Figure 6）
（a）兩組克隆的日均活力與峰值 VCD；（b）兩組克隆的日均 VolP；（c）兩組克隆的日均 qP；（d）兩組克隆的日均產(chǎn)量與總產(chǎn)量

3.4 生物反應(yīng)器放大驗證：灌注培養(yǎng) CLD 流程優(yōu)勢持續(xù)存在 3.4.1 Mobius? breez 微生物反應(yīng)器驗證

將 21 個克隆在 Mobius? breez 微生物反應(yīng)器中進行動態(tài)灌注培養(yǎng)（1VVD 灌注速率），結(jié)果與半灌注 assay 趨勢一致（圖 7）：

細胞活力：流加培養(yǎng)組克隆的平均最低活力（94±4%）與灌注培養(yǎng)組（93±2%）無顯著差異，僅 2 個流加培養(yǎng)組克隆的最低活力低于 90%（圖 7a）。

活細胞密度（VCD）：流加培養(yǎng)組克隆的平均峰值 VCD（131.4±42.7×10?活細胞 /mL）較灌注培養(yǎng)組（96.9±28.2×10?活細胞 /mL）高 30%，差異具有統(tǒng)計學意義（圖 7b）。

體積生產(chǎn)力（VolP）：灌注培養(yǎng)組克隆的平均峰值 VolP（1489±299μg/mL/day）較流加培養(yǎng)組（1230±125μg/mL/day）高 21%（圖 7c）。

比生產(chǎn)力（qP）：灌注培養(yǎng)組克隆的平均峰值 qP（24.8±10.8pg?cell?1?day?1）較流加培養(yǎng)組（15.0±7.4pg?cell?1?day?1）高 65%，差異顯著（圖 7d）。

圖 7：兩種 CLD 流程克隆在 Mobius? breez 微生物反應(yīng)器中的性能對比（來源：原文 Figure 7）
（a）兩組克隆的日均活力；（b）兩組克隆的峰值 VCD；（c）兩組克隆的峰值 VolP；（d）兩組克隆的峰值 qP

3.4.2 3L 生物反應(yīng)器驗證

選取兩種流程的各 2 個最優(yōu)克隆在 3L 玻璃生物反應(yīng)器中驗證，結(jié)果進一步確認：

流加培養(yǎng)組克隆的峰值 VCD 較灌注培養(yǎng)組高 18%；

灌注培養(yǎng)組克隆的峰值 VolP 和 qP 分別較流加培養(yǎng)組高 21% 和 45%；

兩組克隆在通氣（sparging）或微通氣器（microsparger）激活方面無顯著差異，但灌注培養(yǎng)組克隆的最小比氣體傳輸速率（CSPRmin）（11pL?cell?1?day?1）較流加培養(yǎng)組（7.5pL?cell?1?day?1）高 45%，提示灌注培養(yǎng)克隆可能需要更多營養(yǎng)供應(yīng)。

3.5 克隆穩(wěn)定性：灌注培養(yǎng) CLD 流程開發(fā)的克隆更穩(wěn)定

對兩種流程的各 8 個克隆進行 20 代傳代（約 60 個群體倍增數(shù)），通過對比 P0 與 P20 代在半灌注 assay 中的 VCD、VolP、qP 評估穩(wěn)定性（偏差≤20% 視為穩(wěn)定，表 2 為克隆排名對比，表 3 為穩(wěn)定性詳細數(shù)據(jù)）：

體積生產(chǎn)力（VolP）：8 個灌注培養(yǎng)組克隆均保持 VolP 穩(wěn)定，而流加培養(yǎng)組僅 6 個克隆穩(wěn)定；

活細胞密度（VCD）：兩組均有 50%（4 個）克隆保持 VCD 穩(wěn)定；

比生產(chǎn)力（qP）：75%（6 個）灌注培養(yǎng)組克隆保持 qP 穩(wěn)定，而流加培養(yǎng)組僅 1 個克隆穩(wěn)定；

綜合穩(wěn)定性：僅 1 個流加培養(yǎng)組克隆在 VCD、VolP、qP 三項指標上均穩(wěn)定，而灌注培養(yǎng)組有 4 個克隆達到全指標穩(wěn)定。

這表明，灌注培養(yǎng) CLD 流程開發(fā)的克隆不僅在灌注工藝中性能更優(yōu)，還具備更出色的長期穩(wěn)定性，更適合商業(yè)化生產(chǎn)。

表 2：兩種 CLD 流程克隆在半灌注 assay 中的關(guān)鍵指標排名對比

表 3：兩種 CLD 流程克隆傳代 20 代后的穩(wěn)定性對比

四、討論：優(yōu)化細胞系開發(fā)流程的核心價值與未來方向 4.1 灌注培養(yǎng) CLD 流程的核心優(yōu)勢與機制

本研究明確證實，針對灌注培養(yǎng)工藝設(shè)計專屬的細胞系開發(fā)（CLD）流程，能顯著提升細胞系在灌注工藝中的性能，其核心優(yōu)勢源于三個關(guān)鍵設(shè)計：

專用培養(yǎng)基：灌注專用培養(yǎng)基（如 EX-CELL? Advanced HD Perfusion Medium）能更好地支持細胞在高營養(yǎng)消耗、高產(chǎn)物收獲的灌注環(huán)境中生長，避免傳統(tǒng)流加培養(yǎng)基導致的 “營養(yǎng)不匹配” 問題；

精準縮小模型：半灌注 assay、Mobius? breez 微生物反應(yīng)器等縮小模型能更真實地模擬商業(yè)化灌注工藝，相比流加縮小模型，可更準確篩選出具備高 qP、適度生長速率的細胞；

多維度篩選標準：不再單一依賴體積生產(chǎn)力（VolP），而是綜合評估 VolP、比生產(chǎn)力（qP）、細胞生長速率及參數(shù)穩(wěn)定性，確保篩選出的細胞能在長期灌注過程中持續(xù)穩(wěn)定產(chǎn)率，而非僅在短期流加培養(yǎng)中表現(xiàn)優(yōu)異。

從機制上看，傳統(tǒng)流加培養(yǎng) CLD 流程本質(zhì)是 “篩選高細胞密度表型”—— 通過選擇能快速增殖、積累大量 biomass 的細胞，實現(xiàn)高 VolP；而灌注培養(yǎng) CLD 流程則是 “篩選高單胞生產(chǎn)力表型”—— 通過專用培養(yǎng)基和模擬灌注的篩選環(huán)境，定向富集具備高效蛋白合成能力（高 qP）的細胞。兩種流程的設(shè)計差異，直接導致了細胞表型的分化，也解釋了為何灌注培養(yǎng) CLD 流程開發(fā)的細胞能在灌注工藝中表現(xiàn)更優(yōu)。

4.2 研究發(fā)現(xiàn)對行業(yè)的關(guān)鍵啟示 4.2.1 細胞系開發(fā)需與目標工藝 “精準匹配”

研究中一個關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是：基于流加培養(yǎng)數(shù)據(jù)篩選的迷你池 / 克隆，可能會遺漏灌注工藝中表現(xiàn)最優(yōu)的候選者（如半灌注 assay 中 qP 最高的 MP25 迷你池，在流加 assay 中未進入前 5）。這意味著，若繼續(xù)沿用 “流加 CLD 流程開發(fā)細胞→改造用于灌注工藝” 的傳統(tǒng)模式，會導致大量優(yōu)質(zhì)灌注細胞系被淘汰，不僅降低工藝效率，還會增加研發(fā)成本與時間。

因此，行業(yè)需建立 “工藝導向的 CLD 流程” 理念：針對流加工藝，可保留傳統(tǒng) CLD 流程；針對灌注等強化工藝，則需采用灌注專用 CLD 流程，從迷你池篩選階段即引入專用培養(yǎng)基和縮小模型，確保每一步篩選都與最終生產(chǎn)工藝的需求一致。

4.2.2 比生產(chǎn)力（qP）是灌注工藝的核心指標

在灌注培養(yǎng)中，VolP 受細胞密度、培養(yǎng)基交換率等多種因素影響，難以直接反映細胞的真實生產(chǎn)能力；而比生產(chǎn)力（qP） 能消除這些干擾，精準衡量單個細胞的蛋白合成效率，是預測灌注工藝性能的關(guān)鍵指標。研究顯示，灌注培養(yǎng) CLD 流程開發(fā)的克隆，qP 較流加培養(yǎng)組高 45%-65%，且這種優(yōu)勢直接轉(zhuǎn)化為 16% 的總蛋白產(chǎn)量提升。

這提示行業(yè)在灌注細胞系篩選中，需將 qP 作為核心指標，而非僅關(guān)注 VolP。同時，可結(jié)合活細胞密度（VCD）、細胞穩(wěn)定性等參數(shù)，建立 “多維度評分體系”，避免因單一指標篩選導致的性能偏差。

4.2.3 縮小模型是 CLD 流程優(yōu)化的關(guān)鍵工具

研究證實，24 深孔板半灌注 assay、Mobius? breez 微生物反應(yīng)器等縮小模型，能有效模擬商業(yè)化灌注工藝的關(guān)鍵特征（如持續(xù)營養(yǎng)供應(yīng)、產(chǎn)物收獲），且成本低、通量高，可在 CLD 早期快速篩選大量候選克隆。例如，通過半灌注 assay 篩選的前 20 個克隆，在 3L 生物反應(yīng)器中仍能保持性能優(yōu)勢，證明縮小模型的篩選結(jié)果具備良好的放大性。

這為行業(yè)提供了實用工具：在 CLD 流程中，可通過 “96 孔板靜態(tài) assay→24/96 深孔板半灌注 assay→微生物反應(yīng)器” 的階梯式縮小模型，逐步縮小候選范圍，既能保證篩選精度，又能大幅降低后期大體積生物反應(yīng)器的實驗成本。

4.3 研究局限性與未來優(yōu)化方向

盡管本研究取得顯著成果，但仍存在三個需進一步解決的問題，也為后續(xù)研究指明了方向：

4.3.1 灌注細胞系的營養(yǎng)消耗問題

研究發(fā)現(xiàn)，灌注培養(yǎng) CLD 流程開發(fā)的克隆，最小比氣體傳輸速率（CSPRmin）較流加培養(yǎng)組高 45%（11pL?cell?1?day?1 vs 7.5pL?cell?1?day?1），表明其對營養(yǎng)（如氧氣、葡萄糖）的需求更高。這可能會增加灌注工藝的培養(yǎng)基消耗成本，需通過兩種方式優(yōu)化：

工藝優(yōu)化：在后續(xù)工藝開發(fā)中，可通過調(diào)整灌注速率（如降低至 0.25VVD 以下）、優(yōu)化培養(yǎng)基配方（如增加關(guān)鍵營養(yǎng)素濃度），降低單位產(chǎn)物的營養(yǎng)消耗；

CLD 流程優(yōu)化：在 CLD 篩選階段，可引入 “低營養(yǎng)環(huán)境篩選”—— 如在半灌注 assay 中降低培養(yǎng)基交換率，定向篩選對營養(yǎng)需求較低的細胞，從源頭減少營養(yǎng)消耗。

4.3.2 不同規(guī)模生物反應(yīng)器的工藝適配性

研究觀察到，在 Mobius? breez 微生物反應(yīng)器中，灌注培養(yǎng)組克隆的氧消耗率較流加培養(yǎng)組高 22%，但在 3L 玻璃生物反應(yīng)器中，兩組克隆的通氣需求無顯著差異。這一差異源于兩種反應(yīng)器的氧傳遞方式不同（微生物反應(yīng)器通過膜的充放氣傳氧，3L 反應(yīng)器通過曝氣器傳氧），提示不同規(guī)模、不同類型的生物反應(yīng)器，可能會對細胞性能產(chǎn)生不同影響。

未來需進一步研究 “CLD 流程 - 縮小模型 - 生產(chǎn)規(guī)模反應(yīng)器” 的適配性，例如：針對不同類型的生產(chǎn)反應(yīng)器（如攪拌罐式、波浪式），開發(fā)對應(yīng)的縮小模型；在 CLD 階段引入多規(guī)模反應(yīng)器驗證，確保篩選出的克隆能在商業(yè)化生產(chǎn)設(shè)備中穩(wěn)定表現(xiàn)。

4.3.3 CLD 流程的效率提升空間

目前，無論是流加還是灌注 CLD 流程，都需經(jīng)歷 “轉(zhuǎn)染→迷你池篩選→單細胞克隆→克隆驗證” 等多個階段，整個周期通常長達 3-6 個月，且需要大量人工操作。研究中，灌注培養(yǎng) CLD 流程雖提升了細胞性能，但未縮短研發(fā)周期或降低操作負擔。

未來可結(jié)合人工智能（AI）與機器學習（ML） 技術(shù)優(yōu)化 CLD 流程：例如，通過 AI 分析大量 CLD 數(shù)據(jù)（如迷你池的 VolP、qP、細胞形態(tài)），建立 “預測模型”，在早期階段即可預測克隆的最終性能，減少后期驗證的候選數(shù)量；利用自動化液體處理系統(tǒng)，實現(xiàn) CLD 流程的高通量自動化操作，縮短研發(fā)時間。此外，可結(jié)合靶向整合技術(shù)（如 PiggyBac 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)），提高轉(zhuǎn)染效率與單克隆穩(wěn)定性，進一步優(yōu)化 CLD 流程。

4.4 長期價值：推動強化生產(chǎn)工藝的商業(yè)化應(yīng)用

灌注等強化生產(chǎn)工藝的最大優(yōu)勢是能實現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)，降低設(shè)施成本與產(chǎn)品價格。但長期以來，適配的細胞系缺乏是制約其商業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵瓶頸。本研究通過優(yōu)化 CLD 流程，解決了這一核心問題 —— 灌注培養(yǎng) CLD 流程開發(fā)的細胞系，不僅生產(chǎn)力高、穩(wěn)定性好，還能保持良好的產(chǎn)物質(zhì)量（糖基化、電荷變異均符合標準），為灌注工藝的大規(guī)模應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

從行業(yè)長期發(fā)展來看，這種 CLD 流程的優(yōu)化，有望推動生物制藥生產(chǎn)從 “批次生產(chǎn)” 向 “連續(xù)生產(chǎn)” 轉(zhuǎn)型：一方面，連續(xù)生產(chǎn)可將生產(chǎn)設(shè)施規(guī)?？s小 50% 以上，大幅降低固定資產(chǎn)投資；另一方面，高生產(chǎn)力、高穩(wěn)定性的細胞系能減少生產(chǎn)批次間的差異，提高產(chǎn)品質(zhì)量一致性，降低質(zhì)量風險。最終，這些進步將轉(zhuǎn)化為更低的藥物生產(chǎn)成本，讓更多患者能獲得可負擔的治療性抗體藥物。

五、研究方法詳解

為確保研究結(jié)果的可重復性，以下對關(guān)鍵實驗方法進行補充說明，涵蓋細胞培養(yǎng)、 assay 操作、檢測方法等核心環(huán)節(jié)：

5.1 細胞系與培養(yǎng)條件

本研究使用的CHOZN? GS?/?細胞，購自 MilliporeSigma，其谷氨酰胺合成酶（GS）基因敲除，可通過 GS 篩選系統(tǒng)實現(xiàn)重組質(zhì)粒的穩(wěn)定整合。細胞常規(guī)培養(yǎng)條件如下：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：EX-CELL? CD CHO Fusion（含 6mM L - 谷氨酰胺，流加 CLD 流程）或 Cellvento? 4CHO-X COMP Expansion Medium（無 L - 谷氨酰胺，灌注 CLD 流程）；

培養(yǎng)環(huán)境：37°C、5% CO?、80% 相對濕度；

搖瓶/反應(yīng)器參數(shù)：TubeSpin? 生物反應(yīng)器管（200 RPM，50mm 軌道振幅，流加培養(yǎng)）或 24 深孔板（320 RPM，25mm 軌道振幅，灌注培養(yǎng)）；

傳代頻率：每 2-3 天傳代一次，接種密度 0.3×10?活細胞 /mL。

5.2 轉(zhuǎn)染與迷你池篩選 5.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

重組質(zhì)粒含三個表達盒：GS 基因（篩選標記）、IgG1 重鏈基因、IgG1 輕鏈基因。轉(zhuǎn)染步驟如下：

轉(zhuǎn)染前 24 小時，將細胞接種至 0.5×10?活細胞 /mL，培養(yǎng)至對數(shù)生長期；

離心收集細胞（220×g，5 分鐘），重懸于無谷氨酰胺的 EX-CELL? CD CHO Fusion 中，調(diào)整密度至 6.25×10?細胞 /mL；

將 30μg 質(zhì)粒（50μL）與 750μL 細胞懸液混合，加入 4mm 電穿孔杯，使用 Gene Pulser XCell 電穿孔儀（Bio-Rad）進行轉(zhuǎn)染，參數(shù)為 300V、950μF、無限電阻；

轉(zhuǎn)染后，細胞轉(zhuǎn)移至含 5mL 預熱培養(yǎng)基的 T-25 培養(yǎng)瓶，37°C 恢復培養(yǎng) 24 小時。

5.2.2 迷你池 GS 篩選

轉(zhuǎn)染后 24 小時，進行谷氨酰胺缺陷篩選：

離心收集細胞（220×g，5 分鐘），去除含谷氨酰胺的培養(yǎng)基；

重懸于 “20% 無谷氨酰胺 EX-CELL? CD CHO Fusion + 80% Cellvento? 4CHO-C Cloning Medium” 混合液中，密度調(diào)整至 25,000 細胞 /mL；

以 5000 細胞/孔的密度接種至 96 孔板（200μL / 孔），37°C 培養(yǎng) 3 周，每周補加 25μL 無谷氨酰胺培養(yǎng)基；

當細胞達到 80% 匯合度時，傳代至新鮮 96 孔板（無谷氨酰胺培養(yǎng)基），用于后續(xù) 7 天靜態(tài) assay。

5.3 關(guān)鍵 assay 操作細節(jié) 5.3.1 7 天靜態(tài) assay

用于迷你池與克隆的初步生產(chǎn)力篩選：

將匯合的 96 孔板細胞傳代至新 96 孔板（含 EX-CELL? CD CHO Fusion），靜態(tài)培養(yǎng) 7 天；

培養(yǎng)結(jié)束后，離心（220×g，5 分鐘），收集 100μL 上清；

使用 Octet? Qke（Sartorius）檢測上清中 IgG1 濃度，計算體積生產(chǎn)力（VolP）。

5.3.2 半灌注 assay（24 深孔板）

模擬灌注工藝的核心篩選步驟：

接種前 3 天，將細胞傳代至 0.5×10?活細胞 /mL，使用灌注專用培養(yǎng)基（EX-CELL? Advanced HD Perfusion Medium）適應(yīng)培養(yǎng)；

接種時，調(diào)整細胞密度至 1.0×10?活細胞 /mL，2mL / 孔接種至 24 深孔板；

培養(yǎng)期間，每日進行 0.5VVD 培養(yǎng)基交換：離心（500×g，5 分鐘）收集細胞，去除上清，重懸于新鮮灌注培養(yǎng)基；

培養(yǎng) 5 天，每日取樣檢測細胞活力（Vi-CELL XR，Beckman-Coulter）、VCD、上清 VolP（Octet? Qke），并計算 qP（qP=VolP/(平均 VCD× 培養(yǎng)時間)）。

5.3.3 Mobius? breez 微生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)

用于克隆的放大驗證：

反應(yīng)器準備：使用 EX-CELL? Advanced HD Perfusion Medium 校準 pH、溶解氧（DO）傳感器，設(shè)置參數(shù)為 37°C、40% DO、pH 7.00±0.02、5Hz 攪拌頻率；

細胞接種：將適應(yīng)培養(yǎng)后的細胞離心（220×g，5 分鐘），重懸于灌注培養(yǎng)基，以 2.0×10?活細胞 /mL 的密度接種至反應(yīng)器；

灌注操作：接種后立即啟動灌注，速率為 1VVD（每日交換 1 倍反應(yīng)器體積的新鮮培養(yǎng)基），同時通過 ATF 系統(tǒng)（交替切向流過濾）移除廢培養(yǎng)基與產(chǎn)物；

樣品檢測：每日取樣檢測細胞活力、VCD、VolP、qP 及代謝物（葡萄糖、乳酸，BioProfile? FLEX2，Nova Biomedical），持續(xù)培養(yǎng) 11 天。

5.4 產(chǎn)物質(zhì)量與基因穩(wěn)定性檢測方法 5.4.1 糖基化分析

采用 SEC-MS（體積排阻色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用）檢測 IgG1 重鏈的糖基化修飾：

蛋白純化：使用 Protein A 樹脂（POROS MabCapture A，ThermoFisher）純化上清中的 IgG1，洗脫緩沖液為 25mM 檸檬酸（pH 3.0），中和后用于分析；

樣品處理：將純化的 IgG1 用二硫蘇糖醇（DTT）還原，分離重鏈與輕鏈；

SEC-MS 檢測：使用 Waters Acquity UPLC 系統(tǒng)，搭配 Tosoh TSK Gel SW3000XL 色譜柱（300×2.0mm，4μm），流動相為 30% 乙腈 + 0.1% 三氟乙酸，流速 0.07mL/min；質(zhì)譜采用 Waters Xevo G2S QTOF，檢測范圍 m/z 400-4000；

數(shù)據(jù)分析：通過 UNIFI 軟件（Waters）對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行解卷積，識別重鏈糖型并計算相對豐度。

5.4.2 電荷變異分析

使用 iCE3 系統(tǒng)（ProteinSimple）進行等電聚焦電泳，檢測 IgG1 的電荷變異：

樣品制備：將純化的 IgG1 與 Pharmalyte?兩性電解質(zhì)（pH 5-8、8-10.5）、pI 標記物（7.65、10.1）混合，加入 1% 甲基纖維素；

電泳操作：在 5cm 毛細管中進行 5.5 分鐘聚焦，280nm 紫外檢測；

數(shù)據(jù)分析：根據(jù) pI 標記物校準電荷變異峰的 pI 值，將主峰左側(cè)定義為 “酸性變異體”，右側(cè)定義為 “堿性變異體”，通過 Empower 3 軟件（Waters）計算各變異體的百分比。

5.4.3 RNA 測序與突變分析

選取 2 個流加培養(yǎng)克隆與 2 個灌注培養(yǎng)克隆，進行 RNA 測序以評估基因穩(wěn)定性：

RNA 提取：培養(yǎng)第 3 天收集 1×10?細胞，使用 Sigma RTN9604 試劑盒提取總 RNA，通過 Agilent 4200 TapeStation 驗證 RNA 質(zhì)量（RIN≥8.0）；

文庫構(gòu)建：采用 Illumina Stranded mRNA Prep 試劑盒構(gòu)建 mRNA 文庫，使用 Illumina RNA UD Indexes Set A 進行索引標記；

測序與分析：在 Illumina NexSeq 2000 平臺進行雙端測序（56 cycles/端），原始數(shù)據(jù)通過 STAR 軟件比對至 CHO 參考基因組，使用 GATK 軟件檢測重鏈、輕鏈 mRNA 的突變位點，過濾映射質(zhì)量得分 < 40 的讀數(shù)，確保突變檢測的準確性。