抗體偶聯(lián)藥物（ADC）是一類(lèi)高效靶向治療化合物，能夠特異性結(jié)合目標(biāo)癌細(xì)胞，最大限度減少副作用，并提供更寬的治療窗口。目前全球已有19款A(yù)DC藥物上市，以及數(shù)百個(gè)ADC藥物處于臨床前研究階段，這充分表明ADC已成為眾多制藥企業(yè)重點(diǎn)關(guān)注的研發(fā)方向。ADC獲批數(shù)量有限的部分原因在于其面臨重大開(kāi)發(fā)挑戰(zhàn)，包括細(xì)胞攝取不足、殘留脫靶效應(yīng)、生產(chǎn)工藝復(fù)雜性及穩(wěn)定性問(wèn)題。細(xì)胞毒性藥物與抗體的結(jié)合可能導(dǎo)致ADC在制造和儲(chǔ)存過(guò)程中容易形成聚集。在生產(chǎn)和治療性藥物產(chǎn)品的生命周期中，保持蛋白質(zhì)的化學(xué)和物理穩(wěn)定性是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

全球已上市19款A(yù)DC藥物制劑處方總結(jié)

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今天為大家解讀一篇關(guān)于ADC藥物制劑和穩(wěn)定性的文章。以期為大家在ADC藥物制劑處方研究上提供思路參考。

1.引言

成功開(kāi)發(fā)ADC需要對(duì)基礎(chǔ)生物學(xué)及其生產(chǎn)工藝所涉化學(xué)過(guò)程具備全面認(rèn)知。ADC的設(shè)計(jì)過(guò)程遠(yuǎn)比簡(jiǎn)單連接單克隆抗體與有效載荷復(fù)雜得多。偶聯(lián)與純化工藝需確保不影響所有組分的分子結(jié)構(gòu)，分析方法則需考慮樣品制備過(guò)程及所用基質(zhì)溶劑體系可能影響測(cè)試樣品的穩(wěn)定性，因此必須充分理解其化學(xué)穩(wěn)定性。制劑開(kāi)發(fā)需穩(wěn)定抗體、小分子載荷及連接子的物理化學(xué)降解途徑，確保長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

由于需同步開(kāi)展單克隆抗體、連接子-載荷及ADC本身的制劑研究，這類(lèi)藥物開(kāi)發(fā)需要消耗大量資源。若連接子-載荷生產(chǎn)場(chǎng)地與偶聯(lián)及制劑灌裝場(chǎng)地不同，則需要制定周密的處理策略，包括單克隆抗體（液態(tài)或冷凍狀態(tài)）的儲(chǔ)存與運(yùn)輸方案。本章將重點(diǎn)闡述確保ADC成功生產(chǎn)的穩(wěn)定性考量、制劑工藝及流程控制要素。

2. ADC的穩(wěn)定性研究

ADC的穩(wěn)定策略方法與抗體穩(wěn)定技術(shù)高度相似，其主要目標(biāo)在于增強(qiáng)化合物的物理化學(xué)穩(wěn)定性——這一理念基于"分子結(jié)構(gòu)的保持與活性/療效存在相關(guān)性"的基本假設(shè)。由于偶聯(lián)過(guò)程可能改變母體抗體的結(jié)構(gòu)，必須充分評(píng)估該過(guò)程對(duì)ADC穩(wěn)定性的影響，這將直接決定制劑配方和生產(chǎn)策略的制定。

2.1.物理穩(wěn)定性

ADC的物理穩(wěn)定性通常取決于其母體單克隆抗體。然而，抗體在偶聯(lián)后可能因表面性質(zhì)改變（如藥物連接導(dǎo)致的疏水性增加）或高級(jí)結(jié)構(gòu)變化引發(fā)新的抗體-抗體相互作用，從而表現(xiàn)出不同的特性?？贵w分子存在多個(gè)可偶聯(lián)位點(diǎn)，三種常用策略包括：載荷-連接子與（1）賴(lài)氨酸殘基的胺基；（2）還原半胱氨酸的巰基；（3）糖基化修飾mAb的氧化糖殘基進(jìn)行偶聯(lián)。胺基偶聯(lián)的一個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)在于，相比IgG1鉸鏈二硫鍵提供的固定數(shù)量巰基（8個(gè)），其可能實(shí)現(xiàn)更高的藥物載量。當(dāng)使用更大分子量的載荷（如細(xì)菌外毒素）時(shí)，空間位阻預(yù)計(jì)將在調(diào)節(jié)抗原/Fc受體結(jié)合方面發(fā)揮重要作用。

與半胱氨酸偶聯(lián)相比，賴(lài)氨酸偶聯(lián)對(duì)母體抗體熱穩(wěn)定性的影響較小，但其對(duì)ADC電荷譜的影響遠(yuǎn)比單純每個(gè)載荷損失一個(gè)正電荷復(fù)雜。實(shí)際上，偶聯(lián)位點(diǎn)的差異可能導(dǎo)致DAR為1時(shí)產(chǎn)生多種帶電異構(gòu)體：前田等人發(fā)現(xiàn)IgG4 ADC的電泳圖譜比另一種IgG4 mAb出現(xiàn)更多峰型。更高DAR值可能源于部分包埋賴(lài)氨酸的偶聯(lián)，這種偶聯(lián)會(huì)改變構(gòu)象，從而導(dǎo)致偶聯(lián)物靜電特性呈現(xiàn)更高異質(zhì)性。此外，由于電荷變化可能改變ADC與其母體抗體相比的藥代動(dòng)力學(xué)特性和組織分布，充分掌握前者的電荷異質(zhì)性至關(guān)重要。

Acchione等通過(guò)對(duì)比兩種不同IgG1發(fā)現(xiàn)，使用多種連接子時(shí)不同F(xiàn)ab結(jié)構(gòu)域會(huì)呈現(xiàn)差異化響應(yīng)。圖1匯總了兩種單抗經(jīng)不同偶聯(lián)化學(xué)修飾后的低溫差示掃描量熱法（DSC）組分位移結(jié)果：胺基偶聯(lián)ADC的穩(wěn)定性變化顯著體現(xiàn)為HyHEL-10（H10）抗體兩個(gè)組分的熔解溫度轉(zhuǎn)變點(diǎn)（Tm值）降低（原始值分別為74.2℃和77.5℃），且這種效應(yīng)隨生物素載量增加而增強(qiáng)。

圖1 生物素負(fù)載量與通過(guò)差示掃描量熱法(DSC)測(cè)得的低溫組分Tm變化之間的相關(guān)性。

在巰基偶聯(lián)樣品中觀察到一個(gè)新轉(zhuǎn)變峰，其熱穩(wěn)定性遠(yuǎn)低于胺基偶聯(lián)組分。研究表明該現(xiàn)象導(dǎo)致ADC穩(wěn)定性顯著低于母體抗體，其部分解鏈起始溫度較母體抗體的轉(zhuǎn)變穩(wěn)定低7.4℃。與H10不同的是，抗6xHis（aHIS）抗體的可見(jiàn)組分/轉(zhuǎn)變峰數(shù)量從四個(gè)（裸抗體與胺基偶聯(lián)ADC）減少至三個(gè)（巰基偶聯(lián)ADC）。胺基偶聯(lián)aHIS ADC的四個(gè)組分即使在高生物素載量下仍基本保持穩(wěn)定（Tm變化＜1℃），而巰基偶聯(lián)aHIS ADC則表現(xiàn)出更顯著的Tm值下降。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，N-連接糖基氧化修飾相比未偶聯(lián)抗體產(chǎn)生的Tm變化最小?？傮w而言，這些結(jié)果表明：即使采用相同連接子，不同IgG偶聯(lián)物產(chǎn)生的ADC對(duì)藥物載量呈現(xiàn)差異性敏感，這為ADC穩(wěn)定性研究提供了重要參考依據(jù)。

Wakankar等人評(píng)估了曲妥珠單抗（Tmab）偶聯(lián)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。研究表明，Tmab的CH2結(jié)構(gòu)域在連接子（T-MCC）附著后熔解溫度（Tm）降低，而在與藥物DM1偶聯(lián)形成T-DM1后進(jìn)一步下降。偶聯(lián)對(duì)CH2結(jié)構(gòu)域的影響最為顯著，因?yàn)樵搮^(qū)域賴(lài)氨酸殘基的高靈活性使其最易發(fā)生偶聯(lián)。該偶聯(lián)工藝導(dǎo)致異質(zhì)性分布，平均每個(gè)Tmab分子連接約3.5個(gè)DM1分子。

T-DM1的異質(zhì)性來(lái)自于Tmab上約88個(gè)可能連接DM1的賴(lài)氨酸位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)可能呈現(xiàn)不同的物理穩(wěn)定性。生產(chǎn)工藝導(dǎo)致賴(lài)氨酸殘基表面電荷中和（這些位點(diǎn)經(jīng)過(guò)修飾和偶聯(lián)），同時(shí)在Tmab表面引入疏水性DM1分子。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)確定T-DM1生產(chǎn)過(guò)程中關(guān)鍵中間體的適宜加工、儲(chǔ)存和處理?xiàng)l件具有重要意義。

就T-DM1、T-MCC和Tmab而言，熱穩(wěn)定性與聚集行為并非完全相關(guān)。在40°C儲(chǔ)存7天后，T-MCC的聚集體形成增加約40%，而Tmab和T-DM1分別增加約0%和11%（圖2）。未觀察到顯著片段化現(xiàn)象。進(jìn)一步研究表明，T-MCC形成的聚集體主要為共價(jià)性質(zhì)，而T-DM1則以非共價(jià)聚集為主。該研究證實(shí)了偶聯(lián)工藝對(duì)母體mAb穩(wěn)定性的預(yù)期影響，并強(qiáng)調(diào)不僅需要理解母體mAb和ADC的穩(wěn)定性，還需關(guān)注中間產(chǎn)物的穩(wěn)定性。

圖2 通過(guò)SEC測(cè)定Tmab、T-MCC和T-DM1在40°C孵育時(shí)聚集體形成的時(shí)間進(jìn)程。

ADC偶聯(lián)位點(diǎn)周?chē)木植勘砻媸杷栽鰪?qiáng)，從而降低膠體穩(wěn)定性。與母體mAb相比，構(gòu)象穩(wěn)定性和膠體穩(wěn)定性的雙重降低導(dǎo)致ADC更易發(fā)生聚集，更高DAR值的組分更易聚集。評(píng)估m(xù)Ab2-ADC（DAR值0-8混合，平均DAR3.6）的物理穩(wěn)定性：在40°C儲(chǔ)存14天后，分離的DAR 0、2、4、6組分聚集體含量分別增加至0.5%、0.7%、4.7%和18%（圖3），而DAR混合對(duì)照組聚集體含量增至14%。

圖3 熱應(yīng)力對(duì)不同DAR值A(chǔ)DC聚合體含量變化影響（儲(chǔ)存溫度40°C），對(duì)照組平均DAR值為3.6。

二硫鍵還原后偶聯(lián)在顯著改變二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的同時(shí)影響物理穩(wěn)定性。Beckley團(tuán)隊(duì)制備了平均DAR分別為2、3.5和6的多種ADC，發(fā)現(xiàn)雖然抗體二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)未受影響，但后者在熱應(yīng)激下更易解折疊。40°C孵育8周顯示，HMWS形成初始速率隨DAR增加而升高。通過(guò)SEC證實(shí)DAR 6和8組分是HMWS形成的主要貢獻(xiàn)者，并推測(cè)CH2結(jié)構(gòu)域是聚集體形成的主因——該結(jié)構(gòu)域在聚集體中已部分解折疊，且其解折疊前的不穩(wěn)定性被認(rèn)為是ADC1形成HMWS的主因。其中一個(gè)復(fù)雜因素是：HMWS可能源自連接6或8個(gè)藥物的抗體，也可能來(lái)自具有適當(dāng)吸光度比值的片段（其計(jì)算DAR值為6或8）。

相反，Adem等人提出局部二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)導(dǎo)致構(gòu)象變化并產(chǎn)生DAR異質(zhì)性分布。更高DAR的ADC預(yù)期物理穩(wěn)定性更差，因?yàn)榫S持四級(jí)結(jié)構(gòu)所需的二硫鍵數(shù)量減少。實(shí)際上，研究者報(bào)告高DAR組分的ADC片段化率更高（可能與鏈間二硫鍵損失更大相關(guān)）：DAR 6組分在40°C儲(chǔ)存14天后片段化從2.9%增至23.4%，而DAR 8組分在40°C僅儲(chǔ)存2天即從45.7%升至65.1%（表1）。相比之下，DAR 0、2、4組分在相同條件下片段化均小于2%。

總之，ADC相比母體mAb呈現(xiàn)降低的構(gòu)象穩(wěn)定性。由于載荷分子的存在，ADC疏水性增強(qiáng)且與DAR值成正比。結(jié)構(gòu)擾動(dòng)主要限于偶聯(lián)位點(diǎn)，遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)域受影響較小。根據(jù)所采用的偶聯(lián)方法，可能產(chǎn)生凈電荷變化及多種帶電異構(gòu)體。所有這些特性都必須在設(shè)計(jì)ADC制劑時(shí)予以綜合考慮。

表1 SEC數(shù)據(jù)顯示：在40°C儲(chǔ)存條件下，采用高離子強(qiáng)度緩沖液（100mM氯化鈉，pH 5.5）配制的ADC，其片段形成具有時(shí)間依賴(lài)性和DAR值依賴(lài)性特征

2.2 化學(xué)穩(wěn)定性

ADC會(huì)延續(xù)母體單克隆抗體的化學(xué)不穩(wěn)定性。例如，若未偶聯(lián)抗體易發(fā)生具有已知pH依賴(lài)性的脫酰胺反應(yīng)，則該降解模式同樣可能存在于ADC中。蛋白質(zhì)化學(xué)不穩(wěn)定性已得到充分研究，因此本文重點(diǎn)討論連接子-載荷的化學(xué)穩(wěn)定性。此外，偶聯(lián)導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)變化可能使母體mAb中未暴露的化學(xué)熱點(diǎn)區(qū)域顯現(xiàn)，但如前一節(jié)所述，結(jié)構(gòu)變化主要局限于偶聯(lián)位點(diǎn)，因此除非化學(xué)熱點(diǎn)位于偶聯(lián)位點(diǎn)附近，否則不太可能改變其暴露程度。

連接子-載荷的化學(xué)特性及抗體上的偶聯(lián)位點(diǎn)是決定ADC化學(xué)穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。理想ADC連接子的重要特性包括：（1）在中性pH血清環(huán)境中保持體內(nèi)穩(wěn)定性；（2）對(duì)內(nèi)源性活性分子（硫醇等）、酶（蛋白酶等）或其他生物分子（白蛋白等）呈惰性；（3）能在靶標(biāo)位點(diǎn)釋放毒性載荷。提前釋放至系統(tǒng)循環(huán)可能損傷正常組織并導(dǎo)致不良反應(yīng)。大多數(shù)連接子可分為可裂解型與不可裂解型：前者依靠特定蛋白酶、溶酶體區(qū)室內(nèi)的pH環(huán)境或胞漿內(nèi)谷胱甘肽等內(nèi)源性硫醇還原作用實(shí)現(xiàn)載荷釋放；而不可裂解型連接子需通過(guò)抗體自身的蛋白水解作用釋放載荷，此時(shí)載荷仍會(huì)連接部分連接子及偶聯(lián)位點(diǎn)的氨基酸殘基。

Senter團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了奧瑞他汀類(lèi)載荷-連接子并考察其化學(xué)穩(wěn)定性。在設(shè)計(jì)pH敏感連接子時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)5-苯甲酰纈草酸奧瑞他汀E（AEVB）的腙鍵在pH7.2條件下相對(duì)穩(wěn)定（t1/2＞60小時(shí)），而在pH5.0條件下易分解（t1/2=3小時(shí)）。Doronina等人比較了血漿環(huán)境中pH敏感連接子（腙鍵）與蛋白酶可裂解連接子的穩(wěn)定性（圖4）：肽鍵連接物（Val-Cit和Phe-Lys）比腙鍵連接物更穩(wěn)定。cBR96-AEVB在人血漿中初期主要形成AEVB，隨后AE隨時(shí)間累積，這與提出的藥物釋放序列一致（先發(fā)生腙鍵水解，隨后酯鍵水解）。小鼠血漿中各時(shí)間點(diǎn)釋放藥物總量與人血漿相似，但主要成分為AE。Satoh與Hosokawa指出這是由于小鼠血漿酯酶活性遠(yuǎn)高于人血漿，導(dǎo)致釋放的AEVB迅速水解而不累積。兩種血漿中藥物釋放均較快，半衰期分別為人血漿2.6天、小鼠血漿2.1天。二肽連接物在血漿中的穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于腙鍵連接物，且僅檢測(cè)到MMAE一種釋放藥物。小鼠血漿中藥釋放速率快于人血漿，Val-Cit肽在兩種血漿中均比Phe-Lys更穩(wěn)定：Val-Cit連接藥物預(yù)計(jì)半衰期在小鼠血漿為30天，人血漿為230天；Phe-Lys連接藥物相應(yīng)半衰期分別為12.5天和80天。因此肽連接子相比腙鍵連接子能賦予更高血漿穩(wěn)定性。西雅圖遺傳學(xué)公司的本妥昔單抗維多汀（Adcetris?）采用纈氨酸-瓜氨酸（vc）通過(guò)胺末端連接自裂解間隔基對(duì)氨基苯甲酰羰基（pabc），vc裂解后pabc基團(tuán)自發(fā)斷裂并釋放天然形式的MMAE載荷。

圖4 各類(lèi)cBR96偶聯(lián)物在37°C孵育的人體和小鼠血漿中的穩(wěn)定性。對(duì)于cBR96-AEVB，藥物釋放百分比對(duì)應(yīng)AEVB與AE的總釋放量；對(duì)于cBR96-Val-Cit-MMAE和cBR96-Phe-Lys-MMAE，藥物釋放百分比對(duì)應(yīng)MMAE的釋放量。

多數(shù)美登素類(lèi)載荷類(lèi)似物的化學(xué)穩(wěn)定性關(guān)注點(diǎn)集中于C3環(huán)位置的N-酰基-N-甲基-L-丙氨酸酯基團(tuán)，該基團(tuán)在溫和堿性條件下易發(fā)生消除反應(yīng)。有趣的是，C3酯對(duì)多種商品化酯酶和脂肪酶的酶促水解表現(xiàn)穩(wěn)定。美登素ADC所用連接子的化學(xué)穩(wěn)定性取決于所選連接化學(xué)類(lèi)型：Fishkin等人推測(cè)溫和水環(huán)境中硫醚-琥珀酰亞胺鍵會(huì)經(jīng)歷化學(xué)氧化及后續(xù)磺氧化物消除。研究者使用N-乙基馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)的模型化合物（DM1-NEM），發(fā)現(xiàn)該偶聯(lián)物在pH7.4 PBS緩沖液37°C儲(chǔ)存時(shí)相當(dāng)穩(wěn)定，而在離體人血漿中37°C儲(chǔ)存40小時(shí)出現(xiàn)約20%裂解及磺酸鹽形成。游離美登素（DM1-SO3?）形成速率隨氧化劑（H?O?）濃度增加而加快，且pH7.4條件下的釋放速率高于pH5.5。在最低測(cè)試H?O?濃度（約3mol%）下，pH7.4儲(chǔ)存40小時(shí)后檢測(cè)到5.6%游離美登素，而低pH條件下＜1%（圖5）。雖然氧化應(yīng)激偶聯(lián)物在環(huán)境條件下18小時(shí)內(nèi)未觀察到游離美登素釋放，但在37°C時(shí)觀察到顯著連接子裂解。

圖5 過(guò)氧化氫和pH值在37°C孵育40小時(shí)后對(duì)游離美登素類(lèi)化合物釋放的影響。DM1-SO3?百分比以共軛物中起始DM1總量的百分比形式報(bào)告。

在吉妥珠單抗奧佐米星（Mylotarg；輝瑞）研發(fā)過(guò)程中，Hamann團(tuán)隊(duì)通過(guò)體外及嚙齒動(dòng)物體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，盡管卡奇霉素結(jié)構(gòu)上存在可還原二硫鍵，但仍需水解裂解位點(diǎn)才能展現(xiàn)強(qiáng)效選擇性細(xì)胞毒性。Hinman等人通過(guò)評(píng)估多種連接子類(lèi)似物，發(fā)現(xiàn)二硫鍵的血清穩(wěn)定性與其鄰近位阻體積成正比。為調(diào)節(jié)腙鍵穩(wěn)定性，Hamann等人采用多種芳香醛酮前體制備腙鍵連接子并進(jìn)行體外篩選：將腙鍵連接物分別在pH4.5和7.4、37°C孵育以模擬溶酶體和循環(huán)系統(tǒng)中的pH環(huán)境。吉妥珠單抗奧佐米星使用的AcBut制備的腙鍵連接子在pH4.5條件下幾乎完全水解，但在pH7.4相對(duì)穩(wěn)定。該腙鍵連接子設(shè)計(jì)在溶酶體低pH環(huán)境下水解釋放，具有酸不穩(wěn)定性，在分析測(cè)試中已知會(huì)在琥珀酸和乙酸存在下水解。

為評(píng)估連接子上的反應(yīng)性基團(tuán)是否影響載荷-連接子的化學(xué)穩(wěn)定性，Alley團(tuán)隊(duì)比較了馬來(lái)酰亞胺己酰-單甲基奧瑞他汀F（mc-MMAF）與溴乙酰胺己酰-單甲基奧瑞他汀F（bac-MMAF）在mAb1FV-C4v2上的穩(wěn)定性。含硫醚-琥珀酰亞胺環(huán)連接的1FV-C4v2-mc-MMAF偶聯(lián)物載荷釋放半衰期為7天，該結(jié)果與Sanderson等人在cAC10-vc-MMAE小鼠體內(nèi)研究獲得的6天半衰期高度吻合。相比之下，形成硫醚-乙酰胺連接的bac-MMAF偶聯(lián)物體內(nèi)穩(wěn)定性更高，在14天檢測(cè)期內(nèi)未觀察到藥物釋放。這種增強(qiáng)的穩(wěn)定性可能源于硫醚-乙酰胺連接缺乏解偶聯(lián)途徑。

如前所述，ADC化學(xué)穩(wěn)定性的關(guān)注重點(diǎn)在于連接子-載荷的化學(xué)特性及偶聯(lián)位點(diǎn)選擇。

3. 制劑處方

ADC穩(wěn)定性的一個(gè)關(guān)鍵考量在于其因疏水性載荷而增強(qiáng)的自締合傾向。自締合可能導(dǎo)致聚集體形成，進(jìn)而影響藥物效力并增加給藥后的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。通常高溶解性是抗體制劑的理想特性，但由于偶聯(lián)會(huì)改變分子的親水-疏水平衡，ADC的溶解度很可能不同于其母體mAb。偶聯(lián)位點(diǎn)與化學(xué)策略的選擇將對(duì)溶解度產(chǎn)生重大影響。Boylan等人曾報(bào)道通過(guò)表面暴露賴(lài)氨酸偶聯(lián)載荷的ADC出現(xiàn)溶解度問(wèn)題，因其導(dǎo)致凈表面電荷減少。雖然抗體在水性緩沖溶液中溶解度最高，但疏水性連接子與載荷更偏好極性有機(jī)溶劑。偶聯(lián)程度的多變性可能進(jìn)一步加劇溶解度問(wèn)題——更高載藥量的組分更易沉淀或聚集。mAb研究已充分證明：靜電表面電位分布不僅影響溶解度，還會(huì)影響熱穩(wěn)定性與粘度。此類(lèi)情況下可通過(guò)改變離子強(qiáng)度、pH值及添加特定輔料（如精氨酸）調(diào)節(jié)溶解度。對(duì)于高疏水性ADC，傳統(tǒng)制劑方法若未同時(shí)改變結(jié)構(gòu)，可能無(wú)法顯著改善溶解度。目前ADC尚未要求高濃度制劑，因此這尚未成為ADC開(kāi)發(fā)的限制因素。

由于ADC的聚集機(jī)制可能不同于母體抗體，適用于mAb的最佳穩(wěn)定條件未必適合疏水性更強(qiáng)的ADC。鑒于此，制劑科學(xué)家應(yīng)借鑒母體mAb的平臺(tái)知識(shí)與穩(wěn)定策略，優(yōu)化制劑條件并篩選與偶聯(lián)工藝、連接子及載荷穩(wěn)定性相容的組分。若穩(wěn)定性限制無(wú)法開(kāi)發(fā)足夠穩(wěn)定的液體制劑，凍干是可行選擇。

單抗制劑開(kāi)發(fā)期間進(jìn)行的研究同樣適用于ADC，例如評(píng)估各種應(yīng)激條件（溫度、pH、震蕩、光照）對(duì)穩(wěn)定性的影響。成功的制劑開(kāi)發(fā)可從確定最佳pH和緩沖體系入手，以平衡mAb與連接子-載荷的多條降解途徑。隨后可遵循相同原則采用類(lèi)似mAb的制劑輔料（如糖類(lèi)、氨基酸、表面活性劑）抑制聚集。ADC制劑開(kāi)發(fā)需特別關(guān)注DAR與物理穩(wěn)定性（包括構(gòu)象穩(wěn)定性和膠體穩(wěn)定性）的關(guān)聯(lián)性。由于去穩(wěn)定化程度與DAR相關(guān)，體系中高DAR組分會(huì)主導(dǎo)產(chǎn)品整體穩(wěn)定性。因此所選偶聯(lián)方法（及由此產(chǎn)生的DAR分布）不僅影響ADC穩(wěn)定性，還可能影響優(yōu)化后制劑的組成。

Adem等人報(bào)道了離子強(qiáng)度對(duì)半胱氨酸偶聯(lián)MMAE-ADC物理穩(wěn)定性的影響：在高離子強(qiáng)度緩沖液（100mM精氨酸乙酸酯，pH5.5）中40°C儲(chǔ)存的樣品顯示聚集體形成隨時(shí)間顯著增加——第一周內(nèi)快速增加約9%，儲(chǔ)存4周后達(dá)約17%（圖6）；5°C或30°C儲(chǔ)存樣品僅出現(xiàn)微量或無(wú)聚集。低離子強(qiáng)度條件下，40°C僅觀察到微量聚集，5°C或30°C儲(chǔ)存無(wú)聚集。

圖6 ADC在低和高離子強(qiáng)度緩沖液中于5℃、30℃和40℃儲(chǔ)存時(shí)的熱穩(wěn)定性。

為探究聚集形成是否依賴(lài)輔料或離子強(qiáng)度，將mAb1-ADC透析至含不同濃度NaCl或精氨酸鹽酸鹽（0-500mM）的pH5.5緩沖液中，并于5、30或40°C孵育。結(jié)果證實(shí)離子強(qiáng)度（而非緩沖體系）導(dǎo)致聚集，但含NaCl溶液的聚集程度高于含精氨酸溶液（圖7a）。作為對(duì)照，將未偶聯(lián)mAb1和mAb2透析至類(lèi)似緩沖液40°C孵育4周，發(fā)現(xiàn)未偶聯(lián)分子聚集形成量遠(yuǎn)低于對(duì)應(yīng)ADC（圖7b）。這些結(jié)果表明增強(qiáng)的聚集形成可能是含MMAE的ADC分子在高離子強(qiáng)度溶液中的普遍特性，且高離子強(qiáng)度環(huán)境主要影響ADC分子的物理穩(wěn)定性。

圖7 (a)通過(guò)SEC測(cè)定高分子量物質(zhì)(HMWS)含量，評(píng)估ADC)含不同濃度氯化鈉或精氨酸的pH5.5緩沖液中40℃儲(chǔ)存4周的熱穩(wěn)定性。(b)mAb1、mAb2抗體及其偶聯(lián)藥物(mAb1 ADC平均DAR=3.5，mAb2 ADC平均DAR=3.6)在不同濃度精氨酸溶液中40℃儲(chǔ)存4周的熱穩(wěn)定性。

Adem團(tuán)隊(duì)還評(píng)估了離子強(qiáng)度對(duì)ADC結(jié)構(gòu)的影響：DSC結(jié)果顯示隨著NaCl濃度從0升至500mM，mAb1的Tm從67°C降至62°C，而偶聯(lián)mAb1-ADC的Tm從63°C降至58°C（圖8）。此外CH2結(jié)構(gòu)域的Tm下降呈現(xiàn)DAR依賴(lài)性（圖9）：含100mM NaCl的樣品Tm低于無(wú)NaCl樣品?？傮w而言，無(wú)論是否含NaCl，未偶聯(lián)分子的Tm值均高于偶聯(lián)分子，表明ADC通過(guò)細(xì)胞毒劑偶聯(lián)發(fā)生了結(jié)構(gòu)改變。開(kāi)發(fā)含高離子強(qiáng)度的制劑需謹(jǐn)慎（特別是高DAR的ADC）——高離子強(qiáng)度環(huán)境會(huì)破壞維持高偶聯(lián)度ADC結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵非共價(jià)相互作用，使分子易受物理應(yīng)力影響并可能導(dǎo)致mAb片段化。這對(duì)于傳統(tǒng)馬來(lái)酰亞胺基偶聯(lián)生產(chǎn)的ADC尤為明顯，而使用NHS或TG（轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）偶聯(lián)的ADC受影響較小。

圖8 差示掃描量熱法（DSC）數(shù)據(jù)顯示，單抗1（mAb1）和單抗1抗體偶聯(lián)藥物（mAb1 ADC）的熔解溫度（Tm）均呈現(xiàn)離子強(qiáng)度依賴(lài)性下降。

圖9 采用低離子強(qiáng)度與高離子強(qiáng)度緩沖液配制的mAb2抗體偶聯(lián)藥物載量組分的差示掃描量熱分析，展示CH2結(jié)構(gòu)域的Tm值。

在前述物理穩(wěn)定性章節(jié)中，Wakankar團(tuán)隊(duì)研究了曲妥珠單抗（Tmab）與其修飾及偶聯(lián)形式的相對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)T-MCC（帶連接子的Tmab）比Tmab或ADC（T-DM1）更不穩(wěn)定：T-MCC的還原型CE-SDS圖譜顯示兩個(gè)主峰對(duì)應(yīng)重鏈（H；分子量約60kDa）和輕鏈（L；分子量約20kDa），另有幾個(gè)峰對(duì)應(yīng)約85、120、140和160kDa分子量。根據(jù)計(jì)算分子量，研究者認(rèn)為這些額外峰對(duì)應(yīng)不同組分（如HL、HH、HHL和HHLL），占總峰面積約45%。這些峰的檢測(cè)表明鏈間交聯(lián)形成涉及二硫鍵之外機(jī)制——可能是T-MCC親核氨基酸側(cè)鏈與其馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)形成分子間交聯(lián)？為驗(yàn)證該假設(shè)，研究者向T-MCC制劑中添加3mM濃度的N-乙?；被幔–ys、Lys、His、Ser和Tyr）。40°C孵育約11天后SEC結(jié)果顯示：添加3mM Cys完全抑制了T-MCC的聚集（10天后約25%）（圖10）；1.2mM Cys（游離馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)摩爾濃度的兩倍）同樣顯著抑制T-MCC聚集；添加Ser和Tyr也使聚集顯著降低約8%。其中Ser的抑制效應(yīng)呈濃度依賴(lài)性：濃度增加四倍導(dǎo)致抑制效果提升三倍。LC-MS分析含不同氨基酸的還原型T-MCC制劑證實(shí)了Cys、Ser和Tyr的抑制效應(yīng)：圖11顯示這些樣品中交聯(lián)HL組分的相對(duì)響應(yīng)值——T-MCC與Cys反應(yīng)產(chǎn)生非常穩(wěn)定的產(chǎn)物，40°C儲(chǔ)存約11天后幾乎未觀察到交聯(lián)物種；含Ser和Tyr的應(yīng)激樣品交聯(lián)HL組分低于對(duì)照組。這種抑制可能源于Cys、Ser和Tyr對(duì)T-MCC上馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的親核加成，從而阻斷重鏈與輕鏈間分子內(nèi)和分子間交聯(lián)形成。

圖10 不同N-乙?；被幔?mM）在40°C儲(chǔ)存條件下對(duì)聚集體形成的影響。對(duì)照組配方為：20mg/mL T-MCC溶于10mM琥珀酸鹽緩沖液（pH 5.0），含6%（w/v）海藻糖和0.02%（w/v）PS20。

圖11 經(jīng)不同N-乙酰化氨基酸處理的T-MCC樣品在熱應(yīng)力作用下交聯(lián)物種水平的差異。交聯(lián)相對(duì)水平通過(guò)解卷積質(zhì)譜數(shù)據(jù)量化。

雖然mAb常用液體制劑，但游離藥物形成風(fēng)險(xiǎn)可能阻礙液體ADC產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。合理設(shè)計(jì)的凍干制劑可顯著增強(qiáng)產(chǎn)品穩(wěn)定性，同時(shí)消除降解風(fēng)險(xiǎn)。從操作安全角度，關(guān)于醫(yī)療人員意外暴露風(fēng)險(xiǎn)在破碎的液體瓶與凍干粉瓶孰高尚無(wú)定論。但ADC的一些獨(dú)特方面值得討論：ADC目標(biāo)劑量通常較低（約幾mg/kg），意味著容器密閉系統(tǒng)中含量低，可復(fù)溶至低濃度。例如本妥昔單抗維多汀和恩美曲妥珠單抗復(fù)溶后濃度分別為5和20mg/mL。在此低濃度下蛋白質(zhì)對(duì) cake 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性貢獻(xiàn)有限，因此可能需要結(jié)晶添加劑。ADC低劑量的一個(gè)實(shí)際好處是使用安慰劑進(jìn)行凍干循環(huán)開(kāi)發(fā)能較好代表ADC制劑，從而緩解物料可獲得性對(duì)研發(fā)活動(dòng)的限制。相反，位點(diǎn)特異性偶聯(lián)生產(chǎn)的ADC與低DAR產(chǎn)品的劑量會(huì)更高。在較高濃度（＞30mg/mL）下ADC可能影響 cake 結(jié)構(gòu)，此時(shí)可能不再需要結(jié)晶輔料。無(wú)論哪種情況，都需評(píng)估ADC劑量與制劑組成對(duì)凍干循環(huán)的影響，旨在確保足夠儲(chǔ)存穩(wěn)定性的同時(shí)最小化循環(huán)時(shí)間。

ADC制劑開(kāi)發(fā)的最后階段涉及患者給藥。這需通過(guò)模擬使用條件的實(shí)驗(yàn)支持：考量ADC稀釋劑與稀釋倍數(shù)、產(chǎn)品接觸材料（如IV袋與管路）、以及醫(yī)護(hù)人員配制與給藥所需的保持時(shí)間與溫度。相較于未偶聯(lián)抗體，ADC額外的疏水性可能影響其使用穩(wěn)定性。更高載藥量的ADC在生理鹽水中可能因鹽析效應(yīng)特別易形成可溶性聚集體和/或不溶性沉淀。體內(nèi)研究表明高DAR組分治療指數(shù)相對(duì)較差，因其清除速率快于低DAR組分。需考慮不僅能保持制劑儲(chǔ)存穩(wěn)定性，還能在給藥過(guò)程及稀釋后運(yùn)輸中維持穩(wěn)定的制劑策略。

4. 流程控制

ADC制備過(guò)程中涉及的多步反應(yīng)需進(jìn)行序列化精細(xì)控制，以確保生產(chǎn)出質(zhì)量穩(wěn)定的藥物制劑。鑒于細(xì)胞毒劑需嚴(yán)格無(wú)菌操作，必須配備專(zhuān)用生產(chǎn)車(chē)間、設(shè)備或一次性系統(tǒng)。此外，生產(chǎn)工藝可能需在不同生產(chǎn)場(chǎng)地分階段進(jìn)行。

ADC生產(chǎn)可分為以下幾類(lèi)：抗體生產(chǎn)、載荷-連接子制備、偶聯(lián)反應(yīng)及最終制劑灌裝。單抗包裝系統(tǒng)的選擇需綜合考慮儲(chǔ)存溫度要求、運(yùn)輸物流及偶聯(lián)工藝步驟。此外，ADC原料藥的儲(chǔ)存還需考慮批量規(guī)模、材料兼容性以及制劑生產(chǎn)廠區(qū)的操作流程。最后，應(yīng)實(shí)施有效的清潔程序與交叉污染預(yù)防措施。使用隔離器雖為理想方案，但常規(guī)操作效率可能受限。高密閉設(shè)施常采用過(guò)氧化物技術(shù)對(duì)處理細(xì)胞毒材料的隔離器或手套箱進(jìn)行消毒/滅菌。盡管這類(lèi)系統(tǒng)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證且對(duì)殘留過(guò)氧化物有限制，但過(guò)氧化物（及其他消毒劑）可能通過(guò)氣相和接觸表面轉(zhuǎn)移至產(chǎn)品，導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化降解?？傮w而言，需基于現(xiàn)有監(jiān)管指南對(duì)ADC生產(chǎn)全流程實(shí)施適當(dāng)控制，項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)進(jìn)行全面的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

通常抗體生產(chǎn)會(huì)選擇具備生物治療化合物處理經(jīng)驗(yàn)與能力的設(shè)施。許多公司現(xiàn)有生物反應(yīng)器設(shè)施的規(guī)模使得單抗生產(chǎn)量遠(yuǎn)高于每批ADC原料藥的需求量。此種情況下，單抗可冷凍儲(chǔ)存并根據(jù)ADC生產(chǎn)需要定量取用。因此需評(píng)估選擇適合長(zhǎng)期儲(chǔ)存單抗和ADC原料藥的包裝系統(tǒng)。單抗冷凍儲(chǔ)存及相關(guān)技術(shù)已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，此處不再贅述。冷凍儲(chǔ)存的另一關(guān)鍵考量是后續(xù)解凍工藝：需明確采用受控/非受控解凍方式、靜置解凍或振蕩解凍、以及解凍溫度與時(shí)長(zhǎng)。對(duì)于受控解凍工藝，現(xiàn)有不同規(guī)格的乙烯-醋酸乙烯酯（EVA）材質(zhì)Celsius?袋，可通過(guò)主動(dòng)冷凍/解凍單元實(shí)現(xiàn)可重復(fù)的凍融操作。低密度聚乙烯（LDPE）材質(zhì)袋也可用于被動(dòng)系統(tǒng)。解凍優(yōu)選在室溫下快速進(jìn)行，以避免冷凍濃縮及相關(guān)降解途徑。應(yīng)設(shè)計(jì)并執(zhí)行涵蓋解凍周期的穩(wěn)定性研究，確保單抗在后續(xù)生產(chǎn)/加工場(chǎng)地的規(guī)范處理。若單抗能耐受運(yùn)輸相關(guān)應(yīng)力，可以液體形式運(yùn)輸至偶聯(lián)場(chǎng)地。通常單抗制劑會(huì)采用針對(duì)振蕩應(yīng)力 minimally protective 的配方——偶聯(lián)前添加表面活性劑會(huì)使ADC后續(xù)純化過(guò)程中表面活性劑水平難以控制，因此單抗制劑一般不含表面活性劑。選擇所有輔料均與偶聯(lián)工藝及后續(xù)純化步驟兼容的單抗制劑具有明顯優(yōu)勢(shì)，可避免偶聯(lián)反應(yīng)前進(jìn)行緩沖液置換，簡(jiǎn)化偶聯(lián)后純化流程。對(duì)于本身易聚集的單抗，可考慮如前所述的重新配方或冷凍方案。

絕大多數(shù)連接子與載荷通過(guò)化學(xué)合成或半合成工藝生產(chǎn)。這些中間體及ADC本身只能在專(zhuān)門(mén)處理高活性藥物的設(shè)施中生產(chǎn)。設(shè)施設(shè)計(jì)要求包括但不限于：物料密閉程序（如封閉容器、隔離器、配備氣鎖和壓差控制的房間）、人員防護(hù)及凈化措施。偶聯(lián)反應(yīng)通常在玻璃或不銹鋼反應(yīng)器中進(jìn)行以兼容有機(jī)溶劑使用。偶聯(lián)完成后，采用超濾/透析（UF/DF）步驟將ADC轉(zhuǎn)化為制劑所需的配方緩沖體系——通常是含低溫/凍干保護(hù)劑（可能含表面活性劑）的優(yōu)選緩沖液。此階段配制好的ADC原料藥可能需暫存一段時(shí)間再進(jìn)行分裝。根據(jù)制劑配方不同，ADC原料藥通常在?20°C或?40°C條件下儲(chǔ)存。

若ADC原料藥與制劑分裝場(chǎng)地分離，需對(duì)OEB-5物料（OEB：職業(yè)暴露 band；有時(shí)采用職業(yè)暴露限值OEL）的運(yùn)輸與處理進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。采用預(yù)滅菌規(guī)格的瓶裝或袋裝系統(tǒng)為包裝容器提供了靈活選擇——聚四氟乙烯（PTFE）、高密度聚乙烯（HDPE）和聚碳酸酯瓶具有極寬的操作溫度范圍（低至?90°C），而聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PETG）的脆化溫度為?40°C。但使用瓶裝系統(tǒng)需為每個(gè)生產(chǎn)步驟建立規(guī)范程序，以確保工藝可重復(fù)性及無(wú)菌性與完整性的維持。必須仔細(xì)考量原料藥灌裝體積和包裝系統(tǒng)選擇對(duì)物流的影響。需提前與分裝場(chǎng)地溝通，確保已完成液狀A(yù)DC原料藥的適當(dāng)穩(wěn)定性研究。應(yīng)開(kāi)展涵蓋凍融次數(shù)、解凍時(shí)長(zhǎng)、解凍振蕩條件及適用穩(wěn)定性評(píng)估的研究，以確保分裝工藝成功且低風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于擁有合適內(nèi)部設(shè)施的企業(yè)，上述挑戰(zhàn)的影響可能較小。

5. 總結(jié)

ADC正逐漸占據(jù)眾多生物制藥企業(yè)研發(fā)管線中日益重要的地位。ADC由三個(gè)獨(dú)特要素（單抗、連接子和載荷）組合而成，每個(gè)組分都具有獨(dú)特的特性與局限性。生產(chǎn)各階段采用的不同輔料及其對(duì)后續(xù)步驟（包括包裝系統(tǒng)選擇）的影響需審慎考量。單抗開(kāi)發(fā)通過(guò)平臺(tái)化方法已實(shí)現(xiàn)常規(guī)化與加速化，但ADC開(kāi)發(fā)不僅受技術(shù)挑戰(zhàn)制約，更因涉及多步驟生產(chǎn)的制造/物流復(fù)雜性而進(jìn)展緩慢。這些領(lǐng)域的突破對(duì)于加速ADC臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。

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