文/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳昌福，武漢科研時(shí)代生物技術(shù)有限公司 周鑫軍

正文/4987字

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陳昌福有話說

致病性細(xì)菌耐藥性問題，與21世紀(jì)人類健康的密切相關(guān)性已經(jīng)逐漸成為世界各國(guó)科學(xué)家的共識(shí)。世界衛(wèi)生組織以及我國(guó)等多個(gè)國(guó)家，為了遏制細(xì)菌耐藥性蔓延而制定了相應(yīng)的行動(dòng)計(jì)劃。

為了響應(yīng)我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委等多個(gè)部門聯(lián)合制定的《遏制細(xì)菌耐藥國(guó)家行動(dòng)計(jì)劃（2016-2020年）》和《遏制微生物耐藥國(guó)家行動(dòng)計(jì)劃（2022~2025）》，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也數(shù)次頒布了《全國(guó)遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃》。

雖然我國(guó)正在強(qiáng)調(diào)無抗養(yǎng)殖等，但是，迄今為止，采用水產(chǎn)用抗微生物獸藥，治療水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的細(xì)菌性疾病，依然是國(guó)內(nèi)外控制水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病最有效的治療方法。而在采用水產(chǎn)用抗微生物藥物治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病之前，完成從患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)獲得分離菌株，并且對(duì)分離致病性菌株完成藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，是確保實(shí)現(xiàn)科學(xué)、精準(zhǔn)、高效治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的前提。

本文指出了在我國(guó)部分水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域的水產(chǎn)服務(wù)人員，在完成從患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)獲得的分離菌株的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用的藥敏實(shí)驗(yàn)方法是相對(duì)簡(jiǎn)單紙片法或者牛津杯法，獲得檢測(cè)結(jié)果雖然可以證明供試藥物是否具有抑、殺菌功效，但是，用這種定性的方法的獲得的檢測(cè)結(jié)果，是不能用于精準(zhǔn)確定治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物用藥劑量的。這是實(shí)現(xiàn)科學(xué)、精準(zhǔn)、高效使用水產(chǎn)用抗微生物獸藥中需要改進(jìn)的藥敏實(shí)驗(yàn)方法內(nèi)容。

抗微生物藥物敏感性檢測(cè)方法

及其對(duì)科學(xué)用藥的重要性

摘要：本文針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中介紹了對(duì)抗微生物藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)檢測(cè)的重要意義及其用藥劑量計(jì)算方法。旨在為科學(xué)地使用抗微生物藥物、避免和減少致病性微生物對(duì)抗微生物藥物產(chǎn)生耐藥性。文章中對(duì)幾種檢測(cè)致病性微生物，對(duì)抗微生物藥物敏感性的檢測(cè)方法，進(jìn)行了重點(diǎn)介紹，指出常用的紙片擴(kuò)散法（K-B法）和牛津杯法只能用于抗微生物藥物定性，而僅依靠K-B法獲得的抗微生物藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果，是難以用于實(shí)際治療疾病時(shí)用藥量計(jì)算的?？刮⑸锼幬镉盟幜康挠?jì)算，需要依靠用試管內(nèi)系列濃度稀釋法，檢測(cè)抗微生物藥物對(duì)致病性微生物的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

關(guān)鍵詞：抗微生物藥物；藥物敏感性試驗(yàn)；最小抑菌濃度；精準(zhǔn)用藥；用藥系數(shù)

最近幾年來，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的人們均可以明顯地感受到，對(duì)由各種致病性細(xì)菌引起的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物傳染性疾病，要實(shí)施有效的藥物治療已經(jīng)變得越來越困難了。人們對(duì)于導(dǎo)致水產(chǎn)用獸藥治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物沒有療效的原因，先后已經(jīng)列出了各種各樣的推測(cè)：首先，有人認(rèn)為是由于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物因近親繁殖等導(dǎo)致了水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物種質(zhì)退化，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中對(duì)養(yǎng)殖水體中常在的致病性細(xì)菌等的免疫抵抗力下降了，更容易感染各種致病性細(xì)菌了；其次，在單位面積水體中放養(yǎng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物苗種數(shù)量大幅度增加，因?yàn)楦呙芏刃纬傻膿頂D因子（crowding factor）等，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生的環(huán)境應(yīng)激性刺激，致使水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物自身免疫系統(tǒng)的免疫防御功能遭受到抑制，對(duì)養(yǎng)殖水體中常在的致病性生物的易感性增加，導(dǎo)致了各種傳染性疾病的多發(fā)；其三，因?yàn)榻┠陙聿粩嗟赝茝V實(shí)施高密度、集約化的水產(chǎn)養(yǎng)殖方式，養(yǎng)殖水體中因?yàn)樗a(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物未攝食的殘餌與排泄的大量糞尿等，造成養(yǎng)殖水體中有機(jī)物大量積累引起養(yǎng)殖水體中的水質(zhì)惡化，直接危及到水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的健康等。這些因素都是能導(dǎo)致水產(chǎn)用獸藥難以有效治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的重要原因。

在我國(guó)以往的水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，有一個(gè)常見的使用水產(chǎn)用獸藥的方法，是直接導(dǎo)致當(dāng)前水產(chǎn)用獸藥難以有效治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的重要原因。這就是因?yàn)榇蠖鄶?shù)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者采用水產(chǎn)用獸藥治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物前，并沒有做到清楚了解致病性生物對(duì)水產(chǎn)用獸藥的敏感性及其敏感程度，不能做到選擇適宜的水產(chǎn)用獸藥做到精準(zhǔn)用藥治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的緣故。而是在采用水產(chǎn)用獸藥治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病時(shí)，幾乎都是在盲目、輪流地使用一些水產(chǎn)用獸藥。盲目、濫用水產(chǎn)用獸藥的結(jié)果，就是導(dǎo)致致病性生物對(duì)水產(chǎn)用獸藥產(chǎn)生越來越嚴(yán)重的耐藥性（drug resistance），長(zhǎng)此以往水產(chǎn)用獸藥在治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中也就失去了應(yīng)有的治療效果。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中濫用水產(chǎn)用抗微生物獸藥防控水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的細(xì)菌性疾病，無疑是對(duì)于遏制細(xì)菌耐藥性快速蔓延不利的。多年來，我們一直提倡在防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病過程中，需要檢測(cè)致病性生物對(duì)水產(chǎn)用獸藥敏感性的基礎(chǔ)上，進(jìn)行科學(xué)選擇和精準(zhǔn)使用水產(chǎn)用獸藥。現(xiàn)在，已經(jīng)有一些水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者開始行動(dòng)起來，從患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)分離致病性生物，在完成對(duì)致病性生物的藥物敏感性檢測(cè)后，選擇適宜的水產(chǎn)用獸藥治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物。毫無疑問，這是科學(xué)診治患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物良好開端，是值得肯定、鼓勵(lì)的方向與行動(dòng)。

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幾種常用的藥敏試驗(yàn)檢測(cè)方法

利用從患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)獲得的分離菌株，在離體條件下完成水產(chǎn)用抗微生物藥物對(duì)分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)，簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn)（Antimicrobial Sensitivity Test，AST）。藥敏試驗(yàn)是指供試藥物抑制或殺滅分離菌株能力的試驗(yàn)。根據(jù)藥敏試驗(yàn)的目的，常用的藥敏試驗(yàn)檢測(cè)方法有紙片擴(kuò)散法、液體培養(yǎng)基稀釋法、瓊脂板稀釋法、E-test法和自動(dòng)化儀器法等，本文根據(jù)我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域的一些實(shí)驗(yàn)室采用的藥敏試驗(yàn)方法，提出部分建議。

1.1紙片擴(kuò)散法

藥敏試驗(yàn)紙片法（disk diffusion method），又稱Kirby-Bauer法，簡(jiǎn)稱K-B法。是一種常用的抗微生物藥物敏感性測(cè)試方法，用于評(píng)估細(xì)菌對(duì)抗微生物藥物的敏感性，屬于定性試驗(yàn)方法。紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)的原理是，將含有定量的抗微生物藥物的紙片貼在接種有待測(cè)菌的固體培養(yǎng)基上，通過抗微生物藥物物在培養(yǎng)基上的擴(kuò)散，觀察是否出現(xiàn)抑菌環(huán)，推斷是否抑制供試細(xì)菌的生長(zhǎng)。藥物擴(kuò)散的距離越遠(yuǎn)，藥物濃度越低抑菌能力越強(qiáng)，因此可根據(jù)抑菌環(huán)的大小，判定藥物對(duì)致病性微生物的抑制作用強(qiáng)弱。

該方法是將含有定量抗微生物藥物的濾紙片（藥敏片），貼在已接種了待測(cè)試的致病性微生物的瓊脂表面上，藥敏片中所含的藥物在瓊脂中擴(kuò)散，隨著擴(kuò)散距離的增加，抗微生物藥物的濃度呈對(duì)數(shù)減少，在紙片的周圍形成藥物濃度梯度。導(dǎo)致藥敏片周圍能抑菌的藥物濃度范圍內(nèi)的致病性微生物就不能生長(zhǎng)，而處于抑菌范圍外的致病性微生物則可以生長(zhǎng)，因此，在藥敏片周圍形成透明的抑菌圈（圖1）。不同抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴(kuò)

圖1 藥敏試驗(yàn)中的紙片法抑菌實(shí)驗(yàn)情景

散速度的影響而可能有所不同，抑菌圈的大小即可以反映測(cè)試致病性細(xì)菌對(duì)藥物的敏感程度（表1），并與該藥物對(duì)測(cè)試致病性微生物的MIC呈負(fù)相關(guān)。

表1藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

注意：（1）具體對(duì)于不同的致病性微生物菌株，不同的抗微生物藥物紙片需參照NCCLs的標(biāo)準(zhǔn)或者CLSI標(biāo)準(zhǔn)。（2）藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)參考表1，多黏菌素抑菌圈；在9mm以上為高敏，6~9mm為低敏，無抑菌圈為不敏。

1.2牛津杯法

藥敏試驗(yàn)牛津杯法（Oxford cup method），是一種用于測(cè)定抗微生物藥物或其他抑菌物質(zhì)活性的實(shí)驗(yàn)方法。用于評(píng)估細(xì)菌對(duì)抗微生物藥物的敏感性，與紙片法一樣，也是屬于定性試驗(yàn)方法。牛津杯法藥敏試驗(yàn)的原理是，將經(jīng)過高壓消毒潔凈牛津杯（不銹鋼小管，通常高約10mm，直徑約6mm）置放于含有一定濃度的抗微生物藥物定量添加在的固體培養(yǎng)基上，通過添加在牛津杯小管中的抗微生物藥物物在培養(yǎng)基上的擴(kuò)散，觀察是否出現(xiàn)抑菌環(huán)，推斷是否抑制供試細(xì)菌的生長(zhǎng)（圖2）。藥物擴(kuò)散的距離越遠(yuǎn)，藥物濃度越低抑菌能力越強(qiáng)，因此可根據(jù)抑菌環(huán)的大小，判定藥物對(duì)致病性微生物的抑制作用強(qiáng)弱。

圖2牛津杯法的定性藥物敏感性實(shí)驗(yàn)情景

1.3液體培養(yǎng)基稀釋法

液體培養(yǎng)基稀釋法（broth dilution method）是另一種常用抗微生物藥物敏感性測(cè)試方法，屬于能定量的藥物敏感性測(cè)定方法。具體的實(shí)驗(yàn)方法就是將抗菌藥物系列稀釋后，與定量供試菌液共孵育一定時(shí)間后，觀察供試抗菌藥物對(duì)供試致病性菌株的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

該方法根據(jù)培養(yǎng)基容器規(guī)格也分為宏量（試管法，圖3）和微量（微孔板法，圖4）兩種。無論是宏量試管法還是微孔板法，根據(jù)將供試抗菌藥物在液體培養(yǎng)基中的含量，制備成2倍比稀釋抗微生物藥物（如200.0、100.0、50.0、25.0、12.5、6.25……mg/L）。最后，在制備好含有系列藥物濃度的定量培養(yǎng)中，添加定量的供試菌液。恒溫培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察藥物對(duì)供試致病性細(xì)菌的MIC。

液體培養(yǎng)基稀釋法的特點(diǎn)是做到了定量檢測(cè)，具有檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但是操作比較繁瑣，消耗時(shí)間較長(zhǎng)等。

圖3液體培養(yǎng)基試管稀釋法檢測(cè)致病性細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）

圖4液體培養(yǎng)基微孔板稀釋法檢測(cè)致病性細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）

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如何利用藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)用水產(chǎn)用獸藥治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物

2.1要正確利用藥敏實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

譬如本文中介紹的紙片擴(kuò)散法和牛津杯法，是屬于利用藥敏實(shí)驗(yàn)為供試藥物定性的方法。其方法獲得的檢測(cè)結(jié)果只能說明供試藥物是否具有抑制或者殺滅致病性生物的功能，譬如供試藥物是采用的水產(chǎn)用抗微生物獸藥的話，藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果只能說明這種供試水產(chǎn)用抗微生物藥物是否還具有抑、殺菌效果。但是，并不能確定使用該藥物劑量能有效地治療水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的細(xì)菌性疾病。因此，采用紙片擴(kuò)散法和牛津杯法完成的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，是不能根據(jù)這種藥物敏感性實(shí)驗(yàn)方法獲得的測(cè)定結(jié)果，獲得精準(zhǔn)用藥的治療疾病藥物劑量的。

2.2水產(chǎn)用抗微生物藥物對(duì)不同患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的用藥系數(shù)

日本學(xué)者采用日清制藥公司生產(chǎn)的水產(chǎn)用醫(yī)藥品，在完成一系列藥物敏感性實(shí)驗(yàn)研究后，確定了對(duì)日本養(yǎng)殖的幾種魚類的抗微生物藥物的用藥系數(shù)（coefficient of administration）。譬如以錦鯉（

Cyprinus carpio

2.3環(huán)境因素對(duì)水產(chǎn)用抗微生物藥物治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的影響

水產(chǎn)用獸藥對(duì)患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物治療疾病的效果，會(huì)或多或少地受到水體環(huán)境和給藥方式等因素的影響。如養(yǎng)殖水體的水溫和pH等均會(huì)影響到水產(chǎn)用獸藥的用藥效果。當(dāng)人們對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物口服給藥時(shí)，還會(huì)受到作為水產(chǎn)用獸藥載體的魚用飼料的理化特性等因素的影響。

為了觀察飼料顆粒大小、養(yǎng)殖水體pH和水溫等因素對(duì)飼料中藥物溶出速率的影響，F(xiàn)ribourgh等將鹽酸土霉素添加在飼料中，使鹽酸土霉素在飼料中的含量達(dá)到1.83 mg/g，制作成兩種不同規(guī)格的圓柱形顆粒飼料，分別將其稱為A與B型顆粒飼料。將這兩種飼料投入到具有不同pH和水溫的水體中以后，測(cè)定了兩種不同規(guī)格藥物飼料中的鹽酸土霉素的溶出速度。

試驗(yàn)方法是分別用紗布將上述兩種藥物飼料包裝后，沉放在1500.0 mL蒸餾水中，在經(jīng)過3、9、15min，取出飼料包裝袋并通過測(cè)定蒸餾水中的抗微生物藥物含量，推定藥物從顆粒飼料中的溶出狀況。結(jié)果見表2。從表2中所列測(cè)定結(jié)果可以看出，水體的水溫與pH均可以影響A和B型飼料中鹽酸土霉素溶出的時(shí)間和速度。

表2鹽酸土霉素從不同直徑顆粒飼料中

的溶出速度比較（Fribourgh等，1969）

* 因?yàn)辂}酸土霉素是通過圓柱形顆粒飼料表面溶出的，將圓柱形飼料的半徑以“r”代表，長(zhǎng)度以“h”代表，表面積/容積比就可以下式計(jì)算。

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作者：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳昌福；武漢科研時(shí)代生物技術(shù)有限公司周鑫軍。

編輯：鄭燕云

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