摘要：百日咳作為一種嚴(yán)重的呼吸道傳染病，雖在全細(xì)胞疫苗（wP）問世后發(fā)病率大幅下降，但隨著無細(xì)胞疫苗（aP）的廣泛應(yīng)用，其發(fā)病率卻出現(xiàn)回升。本文從百日咳疫苗的發(fā)展現(xiàn)狀出發(fā)，詳細(xì)介紹了現(xiàn)有疫苗的抗原成分、聯(lián)合疫苗的種類，深入分析了疫苗效果不佳的原因，重點(diǎn)探討了新型佐劑在提升疫苗免疫效果方面的作用，包括不同類型佐劑的作用機(jī)制、臨床前研究成果等，同時(shí)還涉及疫苗穩(wěn)定性及未來發(fā)展方向，為新一代百日咳疫苗的研發(fā)提供全面且易懂的參考。

一、百日咳與疫苗的 “前世今生”

百日咳是由百日咳桿菌引起的一種嚴(yán)重傳染性呼吸道疾病，對(duì)嬰兒、兒童和成人都有威脅?；仡櫄v史，1948 年全細(xì)胞百日咳（wP）疫苗的研發(fā)是一個(gè)重要里程碑。在這之前，1940 年百日咳的發(fā)病率為每 10 萬人 157 例，而到了 1973 年，這一數(shù)字降至每 10 萬人 1 例，足見 wP 疫苗的顯著效果。

然而，wP 疫苗雖有效，但安全性方面存在不足。相比之下，無細(xì)胞百日咳（aP）疫苗憑借更好的安全記錄逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位。但近年來，百日咳疫情的反彈令人擔(dān)憂。2020 - 2022 年期間，由于新冠疫情期間廣泛的公共衛(wèi)生措施，百日咳報(bào)告病例數(shù)和發(fā)病率有所下降，2022 年全球報(bào)告病例為 62646 例。但 2023 年，全球百日咳病例數(shù)增至 158910 例，截至 2024 年 11 月 30 日，美國報(bào)告的百日咳病例數(shù)是 2023 年同期的六倍多。

百日咳卷土重來的原因眾多。首先是疫苗覆蓋率存在地區(qū)差異；其次，自然感染或接種疫苗獲得的免疫力會(huì)隨時(shí)間逐漸下降；再者，一些百日咳桿菌菌株不再產(chǎn)生某些疫苗抗原（如 PRN），這使其在接種aP疫苗的人群中更易存活；另外，疫苗中缺乏像腺苷酸環(huán)化酶毒素這樣能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的毒力因子，且某些抗原（如絲狀血凝素）的免疫調(diào)節(jié)活性有限，會(huì)促進(jìn)免疫抑制性細(xì)胞因子的產(chǎn)生等。還有一個(gè)關(guān)鍵因素是，aP 疫苗替代 wP 疫苗后，無法提供最佳的免疫增強(qiáng)效果和長期保護(hù)，這與兩種疫苗使用鋁佐劑所引發(fā)的不同免疫刺激密切相關(guān)。

二、無細(xì)胞百日咳疫苗的抗原成分

百日咳桿菌是一種感染呼吸道的人類病原體，在宿主的黏膜表面會(huì)產(chǎn)生多種毒力因子，這些毒力因子常被納入 aP 疫苗，在預(yù)防百日咳感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

（一）百日咳毒素（PT）

PT 是一種分泌到細(xì)胞外的毒素，也是百日咳桿菌的關(guān)鍵毒力因子，在百日咳的發(fā)病機(jī)制中處于核心地位，被廣泛認(rèn)為是導(dǎo)致百日咳臨床癥狀的主要因素。疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的血清中 PT 特異性 IgG 水平與對(duì)百日咳的保護(hù)作用密切相關(guān)，因此 PT 是目前所有 aP 疫苗中最具代表性的抗原。

PT 遵循經(jīng)典的細(xì)菌毒素 A/B 模型，A 組分具有酶活性，B 組分負(fù)責(zé)與靶細(xì)胞受體結(jié)合。在小鼠鼻內(nèi)感染模型中，PT 會(huì)特異性地靶向氣道駐留巨噬細(xì)胞，促進(jìn)百日咳桿菌在呼吸道的早期定植，同時(shí)還會(huì)抑制中性粒細(xì)胞的募集，幫助細(xì)菌逃避早期免疫攻擊。多項(xiàng)研究表明，抗 PT 抗體能有效保護(hù)小鼠免受腦內(nèi)（IC）攻擊。1997 年，丹麥批準(zhǔn)了一種含過氧化氫滅活 PT 的單組分 aP 疫苗，該疫苗用于嬰兒初次接種（DTaP - IPV）和兒童加強(qiáng)劑量接種（TdaP 和 TdaP - IPV），盡管僅以 PT 為唯一抗原，但丹麥的百日咳負(fù)擔(dān)與使用多組分 aP 疫苗的鄰國相當(dāng)。

（二）絲狀血凝素（FHA）

與細(xì)菌毒素 PT 不同，F(xiàn)HA 主要參與細(xì)菌對(duì)氣管上皮細(xì)胞的黏附，它是一種螺旋狀蛋白質(zhì)，可釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。FHA 內(nèi)的多個(gè)結(jié)構(gòu)域有助于其與巨噬細(xì)胞和呼吸道上皮細(xì)胞結(jié)合。

木村等人的研究顯示，通過腹腔或肌肉注射 FHA 免疫小鼠后，小鼠會(huì)產(chǎn)生 FHA 特異性抗體，氣管和肺部的細(xì)菌定植量減少。在一項(xiàng)人體研究中，日本的一種含 PT 和 FHA 的雙組分疫苗在 3 年多的時(shí)間里提供了比單組分 PT 疫苗更好的長期保護(hù)。瑞典的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)評(píng)估了單組分（僅 PT，JNIH - 7）和雙組分（PT + FHA，JNIH - 6）疫苗在 5 - 11 個(gè)月大嬰兒中的療效。在第二次接種后 30 天開始的 15 個(gè)月隨訪中，單組分疫苗組有 27 人確診百日咳，雙組分疫苗組有 18 人，估計(jì)保護(hù)效力分別為 54% 和 69%。重要的是，進(jìn)一步的隨訪表明，與單獨(dú)使用 PT 相比，加入 FHA 能顯著降低百日咳桿菌感染的發(fā)生率。

（三）百日咳黏附素（PRN）

PRN 是一種與細(xì)菌表面相關(guān)的蛋白質(zhì)，通過其精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸基序和富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域促進(jìn)對(duì)氣管上皮細(xì)胞的吸附。在小鼠模型中，PRN 通過抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的清除作用促進(jìn)發(fā)病，并引發(fā)炎癥，從而增加細(xì)菌的脫落和傳播。研究表明，用 PRN 免疫可抑制肺部細(xì)菌增殖，有助于感染的早期清除。

（四）菌毛（FIM）

FIM 是細(xì)菌表面表達(dá)的絲狀聚集蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，作為黏附素促進(jìn)細(xì)菌與宿主組織的黏附。主要有兩種血清型，F(xiàn)IM2 和 FIM3，代表不同的菌毛結(jié)構(gòu)。

Holuboval 等人證明，F(xiàn)HA 和 FIM 介導(dǎo)的共黏附對(duì)于鼻定植、分泌物誘導(dǎo)、脫落以及隨后的宿主間傳播至關(guān)重要。小鼠研究顯示，增加 aP 疫苗中 FIM 的含量可增強(qiáng)保護(hù)作用，且不會(huì)增加反應(yīng)原性。瑞典的臨床試驗(yàn)比較了雙組分、三組分和五組分 aP 疫苗與全細(xì)胞百日咳（wP）疫苗的效果，發(fā)現(xiàn)雙組分疫苗的效力顯著較低。五組分、三組分 aP 疫苗以及 wP 疫苗在預(yù)防至少持續(xù) 21 天的陣發(fā)性咳嗽的培養(yǎng)確診百日咳方面具有相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用，但三組分疫苗對(duì)輕度疾病的保護(hù)作用相對(duì)較弱，這表明 FIM 在減少感染和傳播方面有一定作用。

圖 1：百日咳桿菌及其毒力因子的示意圖
百日咳桿菌產(chǎn)生多種毒力因子，包括百日咳毒素（PT）、腺苷酸環(huán)化酶毒素（ACT）、氣管細(xì)胞毒素（TCT）、皮膚壞死毒素（DNT）、絲狀血凝素（FHA）、菌毛（FIM）、百日咳黏附素（PRN）、博德特氏菌抗殺傷抗原（BrkA）和氣管定植因子（TCF）。

三、無細(xì)胞百日咳聯(lián)合疫苗

這些百日咳抗原通常與破傷風(fēng)和白喉毒素聯(lián)合使用。FDA 批準(zhǔn)的人類聯(lián)合疫苗包括用于兒童的 INFANRIX（葛蘭素史克生物制品公司）和 DAPTACEL（賽諾菲巴斯德公司），以及用于青少年和成人的 BOOSTRIX（葛蘭素史克生物制品公司）和 Adacel（賽諾菲巴斯德公司）。青少年和成人疫苗中百日咳抗原和白喉類毒素的含量低于兒童疫苗，而破傷風(fēng)類毒素的含量大致相同。

DAPTACEL（賽諾菲巴斯德公司）和 Adacel（賽諾菲巴斯德公司）是五組分疫苗制劑，含有磷酸鋁佐劑；而 INFANRIX（葛蘭素史克生物制品公司）和 BOOSTRIX（葛蘭素史克生物制品公司）是三組分疫苗制劑（不含 2 型和 3 型 FIM）。Susanna Esposito 和 Nicola Principi 對(duì) Greco 和 Gustafsson 的研究總結(jié)指出，三組分和五組分疫苗的效力似乎相似。然而，Carvalho 等人報(bào)告稱，接種三抗原（aP3）aP 疫苗的兒童比接種 wP 疫苗的兒童更易感染百日咳，而在初次接種中接種五抗原（aP5）aP 疫苗的兒童感染百日咳的風(fēng)險(xiǎn)與接種 wP 疫苗的兒童相似。

除了傳統(tǒng)的破傷風(fēng) - 白喉 - 百日咳疫苗外，聯(lián)合疫苗還可能包含其他抗原。例如，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)的疫苗 KINRIX（葛蘭素史克生物制品公司）和 Quadracel（賽諾菲巴斯德公司）與脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原聯(lián)合使用，分別使用氫氧化鋁佐劑和磷酸鋁佐劑。PEDIARIX（葛蘭素史克生物制品公司）與乙肝抗原和脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原聯(lián)合使用，白喉和破傷風(fēng)類毒素以及百日咳抗原（PT、FHA 和 PRN）吸附在氫氧化鋁上，乙肝成分吸附在磷酸鋁上。為預(yù)防 B 型流感嗜血桿菌（Hib）引起的侵襲性疾病，VAXELIS（MCM 疫苗公司）和 Pentacel（賽諾菲巴斯德公司）中添加了蛋白質(zhì)結(jié)合的多核糖基核糖醇磷酸（PRP）以增強(qiáng)免疫原性。PRP 是侵襲性 Hib 疾病的主要毒力因子，是一種具有良好保護(hù)效果的高度免疫原性抗原。VAXELIS 中包含 PRP 與 B 群腦膜炎奈瑟菌外膜蛋白復(fù)合物（OMPC）的共價(jià)結(jié)合物，吸附在無定形羥基磷酸鋁硫酸鹽上，乙肝也吸附在無定形羥基磷酸鋁硫酸鹽上，而白喉和破傷風(fēng)類毒素以及百日咳抗原分別吸附在磷酸鋁上。Pentacel 中包含 PRP 與破傷風(fēng)類毒素的共價(jià)結(jié)合物，以及吸附在磷酸鋁上的白喉、破傷風(fēng)類毒素和百日咳抗原。

表 1：FDA 批準(zhǔn)的含百日咳抗原的人用疫苗

四、無細(xì)胞百日咳聯(lián)合疫苗的佐劑

為增強(qiáng)免疫原性，aP 疫苗通常會(huì)添加佐劑。佐劑用于滅活疫苗、亞單位疫苗和重組疫苗中，以刺激先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，從而獲得最佳且持久的免疫原性。

過去人們認(rèn)為百日咳桿菌是一種特殊的胞外病原體，含鋁鹽佐劑的 aP 疫苗誘導(dǎo)的強(qiáng)大體液免疫足以預(yù)防百日咳桿菌感染。但后來發(fā)現(xiàn)，百日咳桿菌能感染并存活于人類肺泡巨噬細(xì)胞和小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞中，細(xì)胞免疫在預(yù)防百日咳中可能起著至關(guān)重要的作用。Mills 等人發(fā)現(xiàn)，即使沒有可檢測到的血清抗體反應(yīng)，CD4 + T 細(xì)胞也能介導(dǎo)細(xì)菌清除，且自然百日咳感染誘導(dǎo)的主要 T 細(xì)胞是分泌 IL - 2 和 IFN - γ 的 CD4 + T 細(xì)胞，IFN - γ 可激活巨噬細(xì)胞以清除細(xì)胞內(nèi)的百日咳桿菌。

在小鼠中，Th1 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)對(duì)于抵抗呼吸道感染引起的百日咳至關(guān)重要（圖 2）。Ross 等人在自然感染百日咳的小鼠肺部發(fā)現(xiàn)了大量百日咳桿菌特異性 Th17 細(xì)胞，他們發(fā)現(xiàn)過繼轉(zhuǎn)移百日咳桿菌特異性 Th1 或 Th17 細(xì)胞能有效保護(hù)小鼠免受百日咳桿菌感染，尤其是當(dāng)這兩種細(xì)胞群一起轉(zhuǎn)移時(shí)。Th1 和 Th17 免疫都有助于小鼠對(duì)百日咳桿菌感染的自然免疫（圖 2）。wP 疫苗也能刺激 Th1 和 Th17 細(xì)胞，在小鼠中提供由 IFN - γ 介導(dǎo)的保護(hù)性免疫，IL - 17A 也有一定作用，盡管程度較輕。然而，IL - 17A 在 aP 疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫中很重要，它通過募集巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞來增強(qiáng)肺部百日咳桿菌的清除。

在狒狒模型中也證實(shí)了 Th1 和 Th17 反應(yīng)的重要性，能刺激 Th1 和 Th17 記憶反應(yīng)的 wP 疫苗能更快地清除感染。與在小鼠中誘導(dǎo) Th2/Th17 免疫反應(yīng)不同，在狒狒中誘導(dǎo) Th1/Th2 反應(yīng)的 aP 疫苗清除感染較慢，且無法有效預(yù)防百日咳桿菌在呼吸道的定植和傳播。這是因?yàn)?wP 疫苗含有大量抗原和潛在佐劑，而 aP 疫苗僅使用單一佐劑和有限的抗原組合，從而引發(fā)不同且更局限的免疫反應(yīng)，這與近年來百日咳的復(fù)發(fā)有關(guān)。因此，除了鋁鹽佐劑外，旨在誘導(dǎo) Th1 和 Th17 反應(yīng)的新型佐劑，如 MF59、AS04、AS01、CpG ODN、Poly（I:C）、TLR7 激動(dòng)劑、脂蛋白、脂質(zhì)體等，在新型百日咳疫苗中也顯示出發(fā)展?jié)摿Γ▓D 3），且在臨床前研究中取得了一定成果（表 2）。

圖 2：小鼠對(duì)百日咳桿菌自然免疫的機(jī)制示意圖
百日咳桿菌初次呼吸道感染后，局部樹突狀細(xì)胞（DCs）捕獲百日咳桿菌抗原，遷移至引流淋巴結(jié)，在特定細(xì)胞因子的作用下刺激初始 CD4 + T 細(xì)胞分化為 Th1 和 Th17 細(xì)胞。分泌 IFN - γ 的 Th1 細(xì)胞激活肺泡巨噬細(xì)胞，清除呼吸道中的百日咳桿菌。Th17 細(xì)胞釋放的 IL - 17 有助于中性粒細(xì)胞募集到肺部。初始 CD4 + T 細(xì)胞也可分化為效應(yīng)記憶 T（TEM）細(xì)胞，遷移至鼻組織和肺部，并作為組織駐留記憶 T（TRM）細(xì)胞保留在那里。再次感染時(shí)，IL - 17 + CD4 + TRM 細(xì)胞擴(kuò)增并募集唾液酸結(jié)合 Ig 樣凝集素（Siglec）- F + 中性粒細(xì)胞，這些中性粒細(xì)胞在鼻咽部形成中性粒細(xì)胞胞外陷阱（NETs）（NETosis）的潛力更高，有助于細(xì)菌清除。B 細(xì)胞在 DCs 和輔助性 T 細(xì)胞的刺激下分化為漿細(xì)胞并分泌抗體。分泌的二聚體 IgA 與 polymeric 免疫球蛋白受體結(jié)合，以分泌型 IgA 的形式釋放到受感染的呼吸道組織中。

圖 3：百日咳疫苗中具有免疫潛力的佐劑
多種佐劑可用于百日咳疫苗，包括明礬、脂質(zhì)體、MF59、CpG ODN、TLR7 激動(dòng)劑、Poly（I:C）、脂蛋白、AS04 等。

（一）鋁鹽佐劑

鋁鹽佐劑被選用于百日咳疫苗，是因?yàn)槠錃v史悠久、符合監(jiān)管要求，且在聯(lián)合疫苗的應(yīng)用中具有后勤優(yōu)勢。傳統(tǒng)上認(rèn)為，鋁鹽佐劑具有 depot 效應(yīng)，能在注射部位持續(xù)釋放抗原。鋁鹽與抗原的結(jié)合可促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞（APCs）的攝取和呈遞。此外，鋁佐劑還能激活 NLRP3 炎癥小體，促進(jìn) IL - 1β 和 IL - 18 的產(chǎn)生。鋁佐劑可促進(jìn)抗體產(chǎn)生和 Th2 反應(yīng)，這與體液免疫有關(guān)。

研究表明，鋁佐劑的類型會(huì)影響免疫反應(yīng)，氫氧化鋁和磷酸鋁均常被用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)。在無細(xì)胞百日咳疫苗中，三組分疫苗 InfanrixTM 或 PediarixTM（抗原吸附在氫氧化鋁上）以及五組分疫苗 PediacelTM 或 PentacelTM（抗原吸附在磷酸鋁上）被廣泛使用（表 1）。Morel 等人比較了含有 PT、PRN 和 FHA 三種抗原的 DTaP3 與 DTaP5 的效果，發(fā)現(xiàn) DTaP3 比 DTaP5 制劑提供更好的保護(hù)和持久性。PediacelTM 在啟動(dòng)體液反應(yīng)方面不如 InfanrixTM 有效，這可能與佐劑類型有關(guān)。疫苗抗原與磷酸鋁的結(jié)合較松散，會(huì)影響抗原反應(yīng)。Deno?l 等人還證明，PRN 更容易從磷酸鋁佐劑上解吸，影響 PRN 抗原反應(yīng)和小鼠肺部清除活性。這表明制劑工藝在刺激免疫反應(yīng)中很重要。

在吸附疫苗的生產(chǎn)中，除了鋁佐劑的類型外，多種因素會(huì)影響抗原與佐劑的吸附。溶液的 pH 值決定了被吸附抗原和佐劑的表面電荷，當(dāng) pH 值介于佐劑和抗原的等電點(diǎn)之間時(shí)，可通過靜電相互作用發(fā)生吸附。溶液中離子的存在，如磷酸鹽和檸檬酸鹽，容易導(dǎo)致抗原解吸。對(duì)于 aP 疫苗這類多抗原吸附疫苗，吸附順序（如順序吸附、競爭性吸附和單獨(dú)吸附）也會(huì)影響吸附行為。

（二）TLR9 激動(dòng)劑

含胞嘧啶-硫代磷酸酯-鳥嘌呤（CpG）基序的寡脫氧核苷酸（ODN）可通過 TLR9 直接刺激抗原呈遞細(xì)胞，從而加速免疫反應(yīng)。CpG ODN 作為一種強(qiáng)效佐劑，可誘導(dǎo) Th1 反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞（CTL）的大量產(chǎn)生和 IFN-γ 的分泌，增強(qiáng)對(duì)抗原的特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。

CpG ODN 1018 被批準(zhǔn)用于乙肝疫苗 HEPLISAV-B，CpG ODN 2006 被批準(zhǔn)用于炭疽疫苗 CYFENDUS。Sugai等人將 CpG-ODN 加入白喉-百日咳-破傷風(fēng)（DPT）疫苗中，評(píng)估明礬和 CpG-ODN 聯(lián)合佐劑的免疫效果。接種含 CpG-ODN 的 DPT 疫苗（DPT-明礬/ODN）的小鼠血清總 IgE 水平顯著降低，血清抗 PT 特異性 IgG2a 滴度升高。此外，還研究了接種后對(duì)口服卵清蛋白（OVA）的抗體反應(yīng)，在接受 DPT-明礬/ODN 的組中，血清中 OVA 特異性 IgE 的產(chǎn)生減少。

DeJong 等人將 CpG 1018 添加到 Tdap 中，誘導(dǎo)更多的 Th1 抗體，增強(qiáng)下呼吸道的保護(hù)作用和細(xì)菌清除率。此外，無論百日咳桿菌菌株是否表達(dá) PRN，Tdap + CpG 1018 都能提供保護(hù)，緩解了人們對(duì) PRN 突變體可能抵抗疫苗介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的擔(dān)憂。Dynavax 進(jìn)行的 1 期試驗(yàn)評(píng)估了試驗(yàn)性破傷風(fēng)/白喉/無細(xì)胞百日咳疫苗與 CpG 1018 佐劑聯(lián)合在成人和青少年中的安全性和免疫原性，結(jié)果顯示安全性和耐受性良好。Tdap-1018 3000μg 誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)與目前市售的成人和青少年用 Boostrix 相當(dāng)或更強(qiáng)。

盡管 CpG 未用于特殊人群的百日咳疫苗，但與三劑鋁佐劑乙肝疫苗相比，兩劑含 CPG1018 的乙肝疫苗在老年人中產(chǎn)生更高的血清保護(hù)水平，且在懷孕期間未觀察到不良妊娠結(jié)局增加。

（三）TLR7 激動(dòng)劑

TLR7 激動(dòng)劑具有佐劑活性，可在多種傳染病中誘導(dǎo) Th1/Th17 反應(yīng)。小分子 TLR7 激動(dòng)劑與鋁佐劑聯(lián)合使用可減輕全身炎癥，減少細(xì)胞因子釋放到血液中，提高其作為佐劑的安全性。

Misiak 等人將 TLR7a（Toll 樣受體 7 激動(dòng)劑）添加到含明礬佐劑的 aP 疫苗中，可將其從誘導(dǎo) Th2 反應(yīng)的疫苗轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo) Th1/Th17 反應(yīng)的疫苗，從而具有更強(qiáng)的保護(hù)能力。明礬 - TLR7a 佐劑疫苗比明礬佐劑疫苗更有效，可促進(jìn) Th1 極化反應(yīng)，且抗原劑量顯著降低。鋁 - TLR7a 佐劑增加了 PT 中和抗體的產(chǎn)生，抑制了 FHA 與肺上皮的結(jié)合，并增強(qiáng)了小鼠氣溶膠攻擊模型的保護(hù)性免疫。

（四）TLR4 激動(dòng)劑

TLR4 激動(dòng)劑 LPS 是百日咳桿菌外膜的天然成分，存在于 wP 疫苗中，可作為天然佐劑幫助誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。3'- O - 脫?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì) A（MPL）是一種脫毒的 LPS 衍生物，可與 TLR4 結(jié)合并促進(jìn)先天免疫反應(yīng)。MPL 與氫氧化鋁佐劑的組合形成 AS04，已被批準(zhǔn)用于乙肝病毒疫苗 FENDRIX 和人乳頭瘤病毒疫苗 CERVARIX。

Geurtsen 等人使用兩種 LPS 類似物（MPL 和腦膜炎奈瑟菌 LpxL2LPS）替代 DTaP 疫苗中的鋁佐劑，發(fā)現(xiàn)將 LPS 類似物納入疫苗可減少肺部定植，誘導(dǎo)更高的 Ptx 特異性 IgG 水平，使反應(yīng)更具 Th1 型反應(yīng)特征，并減少Ⅰ型超敏反應(yīng)。Agnolon 等人評(píng)估了乳劑佐劑 MF59 和 TLR4 激動(dòng)劑單磷酰脂質(zhì) A（MPLA）與氫氧化鋁（明礬）的組合，添加 MPLA 和 MF59 可增加 IgG2a 抗體滴度，刺激 IgG2a/Th1 反應(yīng)，增強(qiáng) DT 的中和活性，并阻斷 FHA 與人類肺上皮細(xì)胞的結(jié)合。

Mitchell 等人認(rèn)為，百日咳桿菌的 TLR4 刺激功能是 wP 疫苗轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)毒素含量極低的 aP 疫苗時(shí)丟失的特性之一，而 TLR4 對(duì)免疫至關(guān)重要。MPL 具有改良百日咳疫苗可能需要的佐劑特性，包括抑制反應(yīng)性、提供更持久的免疫力和減少 Th2 偏向。此外，AS04 具有良好的安全性，在受孕前 60 天至分娩期間接種 AS04 - HPV - 16/18 疫苗不會(huì)增加致畸風(fēng)險(xiǎn)，AS04 佐劑非常適合用于百日咳疫苗。

（五）TLR2 激動(dòng)劑

百日咳桿菌表達(dá)多種脂蛋白，作為 TLR2 激動(dòng)劑，同時(shí)也具有抗原特性。Dunne 等人從百日咳桿菌中純化出一種新型 TLR2 激活脂蛋白 BP1569，表明相應(yīng)的合成脂肽 LP1569 能有效刺激免疫系統(tǒng)，具有佐劑特性，可誘導(dǎo) Th1 和 Th17 反應(yīng)。在預(yù)防小鼠百日咳桿菌定植方面，它比鋁基疫苗更有效。

（六）MF59

MF59 由角鯊烯、聚山梨酯 80、山梨糖醇三油酸酯和脫水檸檬酸三鈉組成，已在 30 個(gè)國家的許可產(chǎn)品中使用，主要用于流感疫苗。MF59 促進(jìn)抗原在注射部位的吸收和免疫細(xì)胞的募集，增強(qiáng)抗原向引流淋巴結(jié)的運(yùn)輸，并加強(qiáng) Th1 和 Th2 的免疫反應(yīng)。

Agnolon 等人發(fā)現(xiàn)，MF59 與 MPLA 和明礬的組合相似，均能增加 IgG2a 抗體滴度，刺激 Th1 反應(yīng)，并通過血清抗體阻斷 FHA 與人類肺上皮細(xì)胞的結(jié)合。與 MPLA 和明礬的組合相比，MF59 被證明是 TT 和 PRN 抗原最有效的佐劑。

MF59 已用于 65 歲以上人群的 Flaud? 流感疫苗，在誘導(dǎo)老年人強(qiáng)烈免疫反應(yīng)方面顯示出巨大潛力。對(duì)接受 Focetria?（MF59 佐劑 A/H1N1 大流行性流感疫苗）的孕婦的研究表明，MF59 佐劑 A/H1N1 大流行性流感疫苗在懷孕期間是安全的。這表明 MF59 也可能在成人百日咳疫苗的加強(qiáng)接種中發(fā)揮作用。

表 2：aP 疫苗中新型佐劑的臨床前研究

五、aP 疫苗的黏膜佐劑

百日咳影響上呼吸道，因此呼吸道黏膜免疫在預(yù)防百日咳感染中至關(guān)重要。人類百日咳感染會(huì)在鼻腔分泌物中產(chǎn)生 IgA，盡管沒有證據(jù)表明 IgA 缺乏與百日咳感染有關(guān)，但恢復(fù)期患者鼻腔洗液中的抗百日咳分泌型 IgA（sIgA）和血清 IgA 已被證明能抑制百日咳桿菌對(duì)人類呼吸道上皮細(xì)胞的黏附。

除了 IgA，組織駐留記憶 T（TRM）細(xì)胞在黏膜免疫中也起著關(guān)鍵作用。在小鼠模型中，分泌 IL - 17 的 CD4 + TRM 細(xì)胞在初次感染時(shí)遷移至鼻組織，隨后介導(dǎo) Siglec - F + 中性粒細(xì)胞的募集。此外，再次感染時(shí) IL - 17 - CD4 + TRM 細(xì)胞在局部擴(kuò)增，有助于從鼻腔清除百日咳桿菌（圖 2）。肌肉注射含鋁佐劑的 aP 疫苗可誘導(dǎo) Th2 免疫，但不會(huì)促進(jìn)呼吸道中的 sIgA 或 TRM 細(xì)胞。因此，黏膜免疫可能在預(yù)防鼻腔定植和感染方面更有效。開發(fā)新型佐劑的目的是促進(jìn)鼻內(nèi)免疫，以預(yù)防細(xì)菌在鼻腔定植和肺部感染。

霍亂毒素（CT）、大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素（LT）及其基因解毒突變體常用作黏膜佐劑。Ryan 等人將 aP 疫苗與無毒突變體 LKT63 或部分酶活性 LTR72 突變體聯(lián)合用于鼻內(nèi)免疫，發(fā)現(xiàn)兩者都能增強(qiáng)抗原特異性血清 IgG 和分泌型 IgA，并加速肺部細(xì)菌清除。無毒突變體 LTK63 可增強(qiáng) Th1 和 Th2 反應(yīng)，而部分酶活性 LTR72 突變體更傾向于 Th2 反應(yīng)。

盡管 LT 可以增強(qiáng)鼻內(nèi) aP 疫苗的免疫反應(yīng)，但 CT 作為百日咳疫苗佐劑的免疫效果并不理想。Herland Berstad 等人發(fā)現(xiàn)，CT 與百日咳桿菌聯(lián)合鼻內(nèi)免疫未能增強(qiáng) IgA 反應(yīng)，反而顯著降低了它，這可能是由于 CT 與鼻上皮相互作用，與百日咳桿菌制劑的成分競爭所致。Isaka 等人還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)重組霍亂毒素 B 亞單位（rCTB）與 DPT 疫苗聯(lián)合用于鼻內(nèi)免疫時(shí)，對(duì)百日咳類毒素（PTd）和福爾馬林處理的絲狀血凝素（fFHA）的黏膜佐劑作用不顯著。

Orr 等人研究了百日咳桿菌的腺苷酸環(huán)化酶毒素（CyaA）作為黏膜佐劑經(jīng)鼻內(nèi)給予小鼠時(shí)的免疫效果。具有酶活性的 CyaA 和缺乏腺苷酸環(huán)化酶活性的 CyaA（CyaA*）與 Prn 共同給藥可顯著增強(qiáng)血清 IgG 反應(yīng)。與 Prn 和 CyaA 相比，Prn 和 CyaA * 免疫導(dǎo)致肺部抗 Prn IgA 反應(yīng)顯著改善。然而，這兩種佐劑都不如 LKT63 有效。

盡管 CT 和 LT 的佐劑活性已被廣泛研究和認(rèn)可，但它們可能導(dǎo)致貝爾氏麻痹，這限制了它們?cè)谌祟愐呙缰械氖褂?。目前正在開發(fā)更安全有效的黏膜佐劑。Shi 等人將基于食品級(jí)乳酸乳球菌的新型細(xì)菌樣顆粒（BLP）黏膜佐劑引入百日咳抗原（如 PT、FHA 和 PRN）中，進(jìn)行腹腔和鼻內(nèi)免疫，發(fā)現(xiàn)與明礬相比，鼻內(nèi)免疫 BLPs 在鼻沖洗液中產(chǎn)生顯著的抗 PT IgA 和抗 FHA IgA，在預(yù)防細(xì)菌定植和肺損傷方面更有效。

Boehm 等人配制了含 curdlan 佐劑（一種來自糞產(chǎn)堿菌的 1,3β 葡聚糖）的 DTaP 疫苗，curdlan 佐劑促進(jìn) DTaP 顆粒在上呼吸道的定位。與原始 DTaP 疫苗相比，curdlan 佐劑雖然沒有增強(qiáng)對(duì) FHA 和 PT 的抗體反應(yīng)，但經(jīng)鼻內(nèi)免疫的含 curdlan 佐劑的疫苗在肺勻漿中誘導(dǎo) IL - 17A 顯著增加。無論腹腔還是鼻內(nèi)給予含 curdlan 佐劑的疫苗，肺中都沒有觀察到 TRM 細(xì)胞的顯著擴(kuò)增。經(jīng)鼻內(nèi)給予的 DTaP 疫苗聯(lián)合 curdlan 佐劑也能從呼吸道清除百日咳桿菌。

Galeas - Pena 等人開發(fā)了一種由 aP 抗原和 T - vant（一種來自細(xì)菌外膜囊泡的新型佐劑）組成的鼻內(nèi)疫苗，該疫苗經(jīng)鼻內(nèi)給藥時(shí)可促進(jìn) Th1 和 Th17 免疫反應(yīng)，擴(kuò)增 CD4 + T 細(xì)胞（可能是常規(guī) TRM 細(xì)胞），并清除肺和鼻咽部的百日咳桿菌，此外，它還能誘導(dǎo)黏膜 IgA 和血清 IgG。

脂質(zhì)體佐劑、STING 和 TLR 激動(dòng)劑及其組合也可作為黏膜佐劑。Asokanathan 等人證明，當(dāng)氫氧化鋁與 CpG - ODN 聯(lián)合使用時(shí)，百日咳疫苗可增加血清 PT、FHA 和 PRN 特異性 IgG 抗體。巨噬細(xì)胞或脾臟上清液中 NO 和 IFN - γ 的水平顯著增加，表明免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)向 Th1。

基于合成脂肽 LP1569 的研究，Allen 等人隨后繼續(xù)使用一種新的佐劑 LP - GMP，其中包含 LP1569 和 c - di - GMP。c - di - GMP 作為細(xì)胞內(nèi)干擾素基因受體刺激因子（STING）。LP - GMP 能夠激活小鼠和人類的 DCs，促進(jìn)有效的 Th1 和 Th17 免疫。當(dāng)與百日咳抗原共同免疫時(shí)，LP - GMP 可預(yù)防百日咳桿菌引起的鼻腔定植和肺部感染，并且在鼻內(nèi)接種時(shí)比腹腔免疫誘導(dǎo)更多的呼吸道 TRM 細(xì)胞，其中很大一部分是分泌 IL - 17 的肺組織駐留 CD4 + 細(xì)胞。

Jiang 等人發(fā)現(xiàn)，鼻內(nèi)給予激動(dòng)劑 c - di - GMP 作為 aP 疫苗的佐劑可誘導(dǎo) Th1 和 Th17 免疫，并顯著增加肺中的 CD4 + TRM 細(xì)胞。含 c - di - GMP 佐劑的 aP 疫苗組比其他組（包括含氫氧化鋁的 aP 疫苗）表現(xiàn)出更好的保護(hù)效果。此外，肺部炎癥細(xì)胞浸潤減少，呼吸道細(xì)菌負(fù)荷也減少。

Aibna 等人將 PRN、FHA 2/3 和百日咳毒素突變體與三重佐劑（包括 Toll 樣受體（TLR）- 3 激動(dòng)劑 poly（I:C）、宿主先天防御肽（IDR - 1002）、聚磷腈載體系統(tǒng)（PCEP）和陽離子 DDAB/DOPE 脂質(zhì)體）聯(lián)合用于鼻內(nèi)免疫。這種疫苗可促進(jìn) Th1 型免疫，產(chǎn)生高 IgG2a 和 IgA 血清抗體滴度，單次給藥后產(chǎn)生鼻腔分泌的 sIgA 抗體。

六、百日咳聯(lián)合疫苗的穩(wěn)定性

如上所述，百日咳聯(lián)合疫苗通常包括白喉、破傷風(fēng)類毒素、百日咳桿菌純化亞單位蛋白、滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原等。這種聯(lián)合疫苗通常需要多次注射，且制成液體制劑，這對(duì)疫苗在長期儲(chǔ)存過程中的穩(wěn)定性提出了很高的要求。

聯(lián)合疫苗的穩(wěn)定性相當(dāng)復(fù)雜，取決于各組分之間的相互作用。當(dāng)疫苗中含有佐劑時(shí)，百日咳抗原、白喉類毒素和乙肝抗原會(huì)競爭佐劑上的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致其他抗原經(jīng)常取代白喉類毒素，從而降低白喉類毒素的效力。

Kalbfleisch 等人研究表明，近 90% 的單價(jià)抗原 DT、TT 和 FHA 可吸附在磷酸鋁上，而 PRN、PT 和 FIM 的吸附率較低。與磷酸鋁吸附后，DT 和 TT 比其他抗原表現(xiàn)出更明顯的結(jié)構(gòu)變化。Duprez 等人對(duì)含基因修飾百日咳毒素（gdPT）和 TLR 激動(dòng)劑（E6020 和 CpG）且吸附于 AlOOH 佐劑的無細(xì)胞百日咳疫苗 Tdap 進(jìn)行了表征，與 Tdap-AlOOH 和 Tdap-E6020（TLR4 激動(dòng)劑）-AlOOH 相比，Tdap-CPG-AlOOH 表現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性，且 FTIR 分析表明，與 PT 相比，gdPT 被 AlOOH 吸附后其二級(jí)結(jié)構(gòu)基本保持不變。

抗原在鋁佐劑上的解吸動(dòng)力學(xué)會(huì)影響儲(chǔ)存穩(wěn)定性。以 Al (OH)?為基礎(chǔ)的 Infanrix 疫苗在 4°C 下儲(chǔ)存長達(dá) 3 年時(shí)，所有批次的 PT、FHA 和 PRN 解吸率分別低于 3%、0.8% 和 0.1%。當(dāng)抗原吸附在 AlPO?上時(shí)，18-24 個(gè)月后 PT 的最大損失為 11-12%，而 PRN 在 2 年后逐漸解吸至 60% 的水平。吸附在磷酸鋁上可能導(dǎo)致對(duì)小鼠鼻內(nèi)百日咳攻擊的保護(hù)效果較差。

此外，防腐劑的存在和極端溫度會(huì)影響百日咳聯(lián)合疫苗的穩(wěn)定性。白喉和破傷風(fēng)類毒素在較高溫度下往往相對(duì)穩(wěn)定，而疫苗效力在冷凍條件下更易降低。高溫和冷凍溫度都會(huì)對(duì)百日咳疫苗產(chǎn)生影響，但冷凍的影響更為顯著。百日咳成分在 22-25°C 下儲(chǔ)存 2-8 周仍能保持 80% 的初始效力，而疫苗在 - 20°C 下保存 15 天，百日咳成分的效力會(huì)降低約 50%。

研究表明，疫苗的冷凍損傷與鋁鹽佐劑有關(guān)。鋁鹽佐劑的存在增加了疫苗對(duì)冷凍溫度的敏感性。冷凍鋁鹽會(huì)破壞疫苗，且冷凍引起的鋁佐劑表面羥基損傷會(huì)減少鋁顆粒之間的排斥力，促進(jìn)聚集體的形成，從而導(dǎo)致疫苗效力下降。Xue 等人發(fā)現(xiàn)，在 DTaP 和 DTwP 疫苗中添加丙二醇賦形劑可以保護(hù)疫苗免受冷凍損傷，且不影響疫苗的 pH 值、粒徑分布和效力。

總體而言，在百日咳聯(lián)合疫苗中，破傷風(fēng)和白喉的成分比百日咳的成分更穩(wěn)定，疫苗的整體穩(wěn)定性受溫度、賦形劑、佐劑等多種因素的影響。由于聯(lián)合疫苗的復(fù)雜性，目前尚未得出明確的結(jié)論。

七、結(jié)論與展望

本文全面概述了當(dāng)前含百日咳抗原的聯(lián)合疫苗，探討了通過加入促進(jìn) Th1 和 Th17 反應(yīng)的佐劑來增強(qiáng) aP 疫苗免疫原性的方法，討論了百日咳聯(lián)合疫苗中一些有前景的佐劑（如 CpG-ODN、MPL 和 LPS）的實(shí)例，為 aP 疫苗制劑中新佐劑的選擇提供了見解。此外，從肌肉注射轉(zhuǎn)向鼻內(nèi)接種百日咳疫苗可能進(jìn)一步提高效力，本文總結(jié)了各種黏膜佐劑在百日咳疫苗中的應(yīng)用，強(qiáng)調(diào)了它們?cè)鰪?qiáng)免疫反應(yīng)的潛力。

理想的佐劑應(yīng)具有廣泛的安全性，易于制造和施用，能有效激活體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并將不良反應(yīng)降至最低。本文概述了各種在臨床前動(dòng)物試驗(yàn)中顯示出保護(hù)作用的新型 aP 疫苗佐劑。其中，CpG、TLR7a、LP1569 和 MPL 在肌肉注射或腹腔注射時(shí)可防止百日咳桿菌在肺部或氣管定植，而鼻內(nèi)施用的黏膜佐劑如 LP-GMP 和 c-di-GMP 甚至可誘導(dǎo)鼻腔黏膜免疫并減少細(xì)菌負(fù)荷。在 Tdap 疫苗中對(duì) MF59 與氫氧化鋁 + MPLA 的比較表明，氫氧化鋁 + MPLA 誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)起效更快。

此外，新型佐劑在百日咳疫苗中尚未直接進(jìn)行比較。然而，先前的研究表明，大多數(shù) TLR 激動(dòng)劑可誘導(dǎo)抗原特異性 CD4 T 細(xì)胞，但只有更強(qiáng)的 TLR7/8 和 TLR3 激動(dòng)劑可誘導(dǎo) CD8 細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞。除免疫效果外，佐劑生產(chǎn)的復(fù)雜性、穩(wěn)定性以及誘導(dǎo)免疫耐受的可能性都需要進(jìn)一步評(píng)估，以避免臨床限制。在臨床試驗(yàn)和市售疫苗中測試的 TLR 激動(dòng)劑表現(xiàn)出穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)和較低的生產(chǎn)成本，使其成為有前景的開發(fā)候選物。與傳統(tǒng)的鋁佐劑不同，TLR 激活劑不需要與抗原吸附，這似乎降低了開發(fā)復(fù)雜性。然而，對(duì)抗原 - 佐劑相互作用產(chǎn)生的穩(wěn)定性和免疫原性的研究仍然至關(guān)重要。多種佐劑的聯(lián)合使用為未來 aP 疫苗的開發(fā)提供了另一條有前景的途徑。我們認(rèn)為，在百日咳疫苗中使用 TLR 激動(dòng)劑，特別是已證明安全的 CpG 和 AS04，將成為一種普遍趨勢。值得注意的是，雖然新型佐劑有助于誘導(dǎo)免疫增強(qiáng)和長期保護(hù)，但尚不清楚它是否能克服抗原缺陷菌株的選擇壓力，這方面還需要更多的研究。

傳統(tǒng)上，新型佐劑的發(fā)現(xiàn)和選擇依賴于對(duì)候選化合物的經(jīng)驗(yàn)性篩選和優(yōu)化，對(duì)其免疫機(jī)制的理解有限。此外，必須仔細(xì)考慮新型佐劑與其他疫苗成分的相互作用。這些傳統(tǒng)方法通常成本高昂、耗時(shí)，并且在對(duì)佐劑機(jī)制和毒性缺乏清晰了解的情況下，難以符合疫苗安全性和有效性標(biāo)準(zhǔn)。因此，開發(fā)含新型佐劑的 aP 聯(lián)合疫苗仍然是一個(gè)復(fù)雜而漫長的過程。

人工智能（AI）的最新進(jìn)展為佐劑的發(fā)現(xiàn)和選擇開辟了新途徑。AI 利用虛擬評(píng)估，根據(jù)候選化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)評(píng)估其生物活性，并預(yù)測它們與特定靶點(diǎn)的相互作用，從而能夠快速識(shí)別活性佐劑。此外，AI 可以通過定量結(jié)構(gòu) - 活性關(guān)系（QSAR）模型研究佐劑的理化性質(zhì)與生物活性之間的關(guān)系，促進(jìn)佐劑制劑的合理優(yōu)化。盡管 AI 技術(shù)尚未廣泛應(yīng)用于 aP 疫苗新型佐劑的開發(fā)，但其改變這一領(lǐng)域的潛力是不可否認(rèn)的。AI 的整合必將推動(dòng) aP 疫苗設(shè)計(jì)和優(yōu)化的重大進(jìn)展。

此外，必須努力提高發(fā)展中國家的百日咳疫苗覆蓋率，降低嬰兒死亡率。在資源有限的偏遠(yuǎn)地區(qū)維持百日咳疫苗的穩(wěn)定性需要對(duì)冷鏈基礎(chǔ)設(shè)施進(jìn)行大量投資。通過賦形劑、佐劑和制劑技術(shù)的進(jìn)步來提高疫苗穩(wěn)定性，有助于確保資源受限的發(fā)展中國家更好地獲得有效的疫苗。

理想的百日咳疫苗應(yīng)具有優(yōu)異的安全性和穩(wěn)定性，能引發(fā)體液和細(xì)胞免疫，提供長期保護(hù)，且不干擾其他疫苗成分的效力。深入了解百日咳聯(lián)合疫苗中佐劑的成分、機(jī)制和類型，可以加速改進(jìn)型百日咳疫苗的開發(fā)和臨床應(yīng)用。通過應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，我們可以更接近實(shí)現(xiàn)高效且全球可及的百日咳疫苗。

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