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免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry, IHC）是利用抗原抗體反應(yīng)以顯示某蛋白的表達(dá)及定位的實驗。這種實驗的獨特之處在于它既直觀地顯示了蛋白在組織及細(xì)胞或細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的定位，又保留了組織樣品的結(jié)構(gòu)特征。IHC 已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究及臨床診斷中。

目前免疫組化尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)計量方法，但已有幾種公認(rèn)的 IHC 計量方法，你真的知道該如何選擇嗎？下面我來一一詳細(xì)介紹，小伙伴們趕緊收藏轉(zhuǎn)發(fā)啦～

一、積分制

積分制是對切片以細(xì)胞染色強度、陽性細(xì)胞范圍進(jìn)行評分，再相乘得出最終得分的方式，這是最常用的方法。

標(biāo)準(zhǔn)評分為：

根據(jù)細(xì)胞染色強度評分為 4 級

• 無陽性著色（陰性）計 0 分

• 淡黃色（弱陽性）計 1 分

• 棕黃色（陽性）計 2 分

• 棕褐色（強陽性）計 3 分

根據(jù)陽性細(xì)胞百分比評為 4 級

• ≤25% 計 1 分

• 26%-50% 計 2 分

• 51%-75% 計 3 分

• ＞75% 計 4 分

將兩項評分相乘得出最終評分結(jié)果 [1-2]。

此種方法是最貼近臨床方面的，小伙伴們?nèi)绻胱瞿骋蜃拥呐R床病理特征分析，那最好采用這種方法。

二、陽性細(xì)胞數(shù)

計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)適用于評估某物質(zhì)是否在組織中存在以及數(shù)量，是對該物質(zhì)數(shù)量而不是表達(dá)強弱的判別。

如評估某細(xì)胞在該組織中的數(shù)量，可利用該細(xì)胞的特異性標(biāo)志物做免疫染色。如 CD163 標(biāo)記 M2 型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，CD34 標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，CD3 標(biāo)記 T 細(xì)胞等等。

對于這類免疫組化，我們直接計數(shù) 20 倍鏡下隨機 5 個視野下的陽性細(xì)胞數(shù)，再求一個平均數(shù)即為這張片子的陽性細(xì)胞數(shù)。

也有計算單位面積下陽性細(xì)胞數(shù)的方法。通過統(tǒng)計 20 倍鏡下的細(xì)胞數(shù)，在除以鏡下面積，得出細(xì)胞密度，單位為 cells/mm2。

三、Image Pro Plus 軟件測量平均光密度值

有時，我們想定量的分析某因子的高低表達(dá)差異，用半定量的積分制并不能很好的區(qū)分差異，我們可使用軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

Image Pro Plus 軟件的計量原理是根據(jù)目的蛋白的著色深淺及分布面積來確定目的蛋白的表達(dá)量。

通過測量出每張圖片的累積光密度值（integrated option density, IOD）值以及區(qū)域面積 area 值，再計算出平均光密度值（mean density）即 mean density=IOD/area，此值反映了目標(biāo)蛋白的單位面積濃度。最后取每個樣本的 5 個隨機區(qū)域 mean density 的平均值即為此樣本的值。

下面我們以分析免疫組化圖片為例講解 IPP 軟件的操作步驟（假設(shè)粉紅色未陽性表達(dá)區(qū)域）。

第一步：處理圖像

我們分析的是免疫組化的圖片，所以先要把圖像 intensity 格式。在默認(rèn)的 intensity 格式中，是圖片灰度，越黑數(shù)值越小，越白數(shù)值越大。而實際上我們測量的染色強度是光密度，染色越深，光密度值越大。如果不進(jìn)行光密度單位的轉(zhuǎn)換，測量的數(shù)值將完全相反的。

方法：measure - calibration - intensity，然后在窗口中點 new 按鈕，再點一下下面的 std optical density 選項，這時可以看到窗口中的直線變成了反向的曲線。

然后點 system - close（IPP 功能多，建議每次都檢查，如果中途不再進(jìn)行別的功能，打開軟件后只要操作一次就行，不用每張圖片都操作）

第二步：顏色選取

明確一個概念 AOI（area of interest），即感興趣的區(qū)域，也是我們觀察的重點，也就是我們說的免疫組化陽性表達(dá)區(qū)域。這里我只介紹入門級的 2 種選擇方法：吸管工具和 HIS 顏色選擇系統(tǒng)。

先介紹吸管工具：

點擊 measure---count/size，跳出如下界面。

點擊 Select Colors，顯示如下。

點擊吸管工具，在圖片上選取 AOI（可以反復(fù)點擊，直到你覺得所有陽性表達(dá)都被選中，當(dāng)然吸管工具右側(cè)，有撤銷，橡皮擦等修改工具）。

經(jīng)過多次點擊，假設(shè)現(xiàn)在所有陽性表達(dá)都已經(jīng)被選中，那么 AOI 選取結(jié)束。

下面介紹 HIS 系統(tǒng)選取顏色：

在 HSI 顏色格式中，H 為色調(diào)，就是我們眼睛所看到的紅橙黃綠青藍(lán)紫等。S 為色飽和度，I 為強度。在選擇 AOI 時，首先保持 S、I 為最大范圍，從 H 中選擇粉色部分。使用這個顏色格式的好處是，選擇的顏色能包括這種顏色的不同深淺及亮度。

顏色選擇好了后，就可以分析了。

*強烈推薦一個功能：點擊左下角 File – save file 將此顏色信息保存，下一張圖片可以調(diào)用此文件，從而減少操作誤差，也簡化了步驟。

第三步：分析

選擇分析參數(shù)：免疫組化常見的幾個參數(shù)（意義不多解釋，可自行搜索）

• area 面積

• density（mean）平均光密度

• diameter 直徑

• IOD（integrated optical density）累積光密度

顏色選好后回到先前界面，點擊 Measure-select Measurements 進(jìn)入選擇測量參數(shù)，最常用的四個參數(shù)已如上述。

這里再介紹一點，可設(shè)置范圍（上圖中間靠下）：每一個陽性表達(dá)區(qū)域都是有大小的，如圖可以將小于 10 的陽性表達(dá)區(qū)域舍棄不計算，這個可以根據(jù)自己實際情況調(diào)整，但一般取默認(rèn)值。點擊 OK，回到原先界面點擊 Count，得出結(jié)果得出結(jié)果（View - Statistics）：

第四步：整理數(shù)據(jù)

File - Export Data 整理

相信，這樣簡單介紹后能用 IPP 處理一些簡單的免疫組化的圖片數(shù)據(jù)。

好了，以上為 3 種免疫組織化學(xué)常用的計量方法，希望對大家免疫組化實驗數(shù)據(jù)處理有所幫助，少走彎路。

具體選擇哪種方法還是要根據(jù)你的研究內(nèi)容和目的，最后祝大家早日發(fā) SCI 呀～

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