在影視作品中，冰系魔法師們往往能瞬間冰封萬(wàn)物，這種極具沖擊力的畫面令人印象深刻，如此將物質(zhì)在極低溫下凍結(jié)的設(shè)定，雖充滿藝術(shù)想象，卻與現(xiàn)實(shí)生活中科學(xué)家們使用的冷凍電鏡技術(shù)（Cryo-Electron Microscopy, Cryo-EM）在核心理念方面存在微妙的聯(lián)系。

冷凍電鏡的核心奧秘正在于它可利用極低的溫度（約-185攝氏度甚至更低）將生物大分子（如蛋白質(zhì)、病毒等）“定格”在電鏡之下，從而捕捉其本真狀態(tài)，為解析生命活動(dòng)的奧秘提供了可能。憑借這項(xiàng)革命性技術(shù)，三位科學(xué)家榮膺2017年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，諾獎(jiǎng)委員會(huì)盛贊其“將生物化學(xué)帶入了新的紀(jì)元”。

2017年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者：雅克·杜博歇、阿希姆·弗蘭克、理查德·亨德森

（圖片來(lái)源：諾貝爾獎(jiǎng)官方網(wǎng)站）

那么，這種技術(shù)為何需要如此極端的低溫？這“冰封”之力的背后到底蘊(yùn)藏著怎樣的科學(xué)原理？今天，我們一起走進(jìn)這個(gè)“冰封的微觀世界”，共同探尋它的奧秘。

為什么要“冷凍”生物大分子？

要理解冷凍電鏡中“冷”的關(guān)鍵意義，首先要明確它要克服的核心挑戰(zhàn)：要觀察天然、完整且具有生命活性的生物大分子（如蛋白質(zhì)、病毒等），必須在接近生理狀態(tài)的水溶液環(huán)境下進(jìn)行。

然而，傳統(tǒng)透射電鏡的工作環(huán)境與維持生物大分子天然狀態(tài)的需求存在根本性沖突，主要體現(xiàn)在三個(gè)方面：

1.高真空導(dǎo)致水環(huán)境喪失：透射電鏡樣本必須維持在高真空環(huán)境中，這是因?yàn)橥干潆婄R是利用電子束作為光源的，而電子束只有在真空中才能保持穩(wěn)定、直線地傳播。如果環(huán)境中存在空氣，空氣中氣體分子就會(huì)與電子束發(fā)生碰撞，使電子束偏離原來(lái)的傳播方向，導(dǎo)致成像模糊，無(wú)法準(zhǔn)確反映樣品的微觀結(jié)構(gòu)。在此條件下，樣本中維持生物分子天然結(jié)構(gòu)所必需的水溶液會(huì)被瞬間抽干，如同水滴落在熾熱的鐵板上。這將導(dǎo)致高度依賴水合層穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重變形甚至塌陷，其天然構(gòu)象徹底喪失。

2.高能電子束造成輻射損傷：在真空環(huán)境中，失去水層保護(hù)的生物大分子直接暴露于透射電鏡的高能電子束下。這些電子束會(huì)如同密集的子彈，直接轟擊樣品中裸露的蛋白質(zhì)，造成嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)損傷，最終獲得的圖像也與其在生物體內(nèi)的真實(shí)狀態(tài)相去甚遠(yuǎn)；

3.布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致成像模糊：在傳統(tǒng)透射電鏡的室溫環(huán)境下，生物大分子持續(xù)進(jìn)行著劇烈且隨機(jī)的布朗運(yùn)動(dòng)。在這種高速運(yùn)動(dòng)下拍下的電鏡成像，就如同用慢快門拍攝快速移動(dòng)的物體——結(jié)果必然是圖像模糊、出現(xiàn)重影，無(wú)法獲得清晰、穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)信息。

傳統(tǒng)透射電鏡的成像原理

（圖片來(lái)源：作者）

冷凍電鏡則通過(guò)革命性的技術(shù)手段，巧妙地解決了上述矛盾：它能將含水的生物大分子溶液樣本，在毫秒級(jí)時(shí)間尺度內(nèi)，急速冷凍至液氮溫度（約-196攝氏度）甚至更低。這種超快速冷凍可使溶液中的水分子來(lái)不及形成破壞性的冰晶，而是形成一種非晶態(tài)的固態(tài)冰（即“玻璃態(tài)冰”）。

玻璃態(tài)冰如同完美的“分子鑄?！保梢詫谄渲械纳锎蠓肿铀查g“凍結(jié)”在其天然的溶液構(gòu)象中，在幫助維持其形貌結(jié)構(gòu)的同時(shí)，超低溫的環(huán)境也限制了蛋白質(zhì)的分子的熱運(yùn)動(dòng)。在冷凍電鏡的腔體中，這種狀態(tài)下的生物樣品在精密調(diào)控的低劑量電子束照射下進(jìn)行成像，最大程度地保留了生物樣品的原始結(jié)構(gòu)。

冷凍電鏡的成像原理

（圖片來(lái)源：參考文獻(xiàn)[6]）

到底要有多“冷”？怎么能做到這么冷？

理解了為什么要“冷凍”生物大分子，現(xiàn)在，我們來(lái)接著探究“冷凍”所需的具體溫度。冷凍電鏡工作時(shí)的核心低溫來(lái)源于使用液氮(-196攝氏度/77開(kāi)爾文)或液氦(零下269攝氏度/4開(kāi)爾文)作為系統(tǒng)中的制冷劑。樣本在投入液乙烷快速冷凍后，會(huì)被轉(zhuǎn)移到特殊的觀察冷臺(tái)上。這個(gè)冷臺(tái)被浸泡在液氮或液氦中冷卻，在整個(gè)電鏡觀察過(guò)程中，樣本溫度始終維持在接近液氮/氦溫度的極寒環(huán)境，即大約-180攝氏度到-269攝氏度。

這種程度到底有多“冷”？可以通過(guò)兩個(gè)對(duì)比直觀感受一下：

-196攝氏度(液氮溫度)：比地球上南極洲的最冷記錄（約-89攝氏度）還要低100多攝氏度！在這個(gè)溫度下，整個(gè)空氣中的氧氣、氮?dú)舛紩?huì)凝結(jié)成液體。

-269攝氏度(液氦溫度)：距離物理學(xué)上的絕對(duì)零度（-273.15攝氏度）僅差4度！這幾乎是常規(guī)情況下人類在實(shí)驗(yàn)室能達(dá)到的最低溫度。想象一下，這是將樣本置于比太陽(yáng)系邊緣冥王星表面（平均約-230攝氏度）還要寒冷近40攝氏度的極寒環(huán)境，生命活動(dòng)在此被近乎徹底“凍結(jié)”。

“冷凍”之后，如何還原生物分子的三維結(jié)構(gòu)？

然而，將含水樣本在不破壞其原始形貌的條件下凍到如此極寒的程度，還只是第一步。要獲得原子級(jí)分辨率（約0.3納米甚至更高）的清晰結(jié)構(gòu)，還需要克服急凍狀態(tài)下，蛋白質(zhì)分子取向隨機(jī)性的挑戰(zhàn)——樣本中成千上萬(wàn)個(gè)相同的分子，被冷凍時(shí)是以隨機(jī)的姿態(tài)“躺”在冰層里的，朝向四面八方，這將導(dǎo)致拍到的生物大分子圖像是蛋白質(zhì)在隨機(jī)一個(gè)方向上的二維投影。

蛋白質(zhì)分子在急凍后樣品中的隨機(jī)取向

（圖片來(lái)源：參考文獻(xiàn)[7]）

不過(guò)，而聰明的科學(xué)家們?cè)缫严氲嚼糜?jì)算機(jī)強(qiáng)大的圖像處理算法和計(jì)算能力將二維的蛋白質(zhì)分子投影還原為三維的立體分子結(jié)構(gòu)：

1.海量數(shù)據(jù)采集：對(duì)于同一樣本區(qū)域的圖像，電鏡自動(dòng)采集數(shù)萬(wàn)、數(shù)十萬(wàn)甚至上百萬(wàn)張不同角度的蛋白質(zhì)顯微照片。

2.優(yōu)選粒子圖像：計(jì)算機(jī)程序從這些海量模糊照片中自動(dòng)識(shí)別、挑選出結(jié)構(gòu)狀態(tài)較好的目標(biāo)分子，獲得數(shù)十萬(wàn)甚至上百萬(wàn)個(gè)“單顆?！眻D像。

3.分類與對(duì)齊：算法根據(jù)分子的不同朝向（隨機(jī)分布的優(yōu)勢(shì)在此體現(xiàn)），將這些單顆粒圖像按照相似的角度進(jìn)行分類，并將同一類別的圖像進(jìn)行精確的對(duì)齊疊加。

4.三維結(jié)構(gòu)重構(gòu)：基于類似CT掃描的電子斷層掃描技術(shù)，計(jì)算機(jī)利用不同角度的二維投影信息，通過(guò)傅里葉變換、迭代優(yōu)化等復(fù)雜的數(shù)學(xué)計(jì)算，最終重構(gòu)出生物大分子的高分辨率三維結(jié)構(gòu)模型。傅里葉變換是指從多角度拍攝樣品的二維投影，經(jīng)數(shù)學(xué)變換后各代表三維物體在不同“頻率空間”中的一個(gè)投影切片。將這些切片按角度拼合成完整的三維頻率圖，再通過(guò)逆變換還原出立體結(jié)構(gòu)。

這個(gè)過(guò)程可以類比為通過(guò)一個(gè)物體的三視圖（如前視圖、側(cè)視圖、俯視圖）來(lái)還原其立體結(jié)構(gòu)。當(dāng)然，蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)比簡(jiǎn)單幾何體復(fù)雜得多，需要整合其海量不同角度的二維投影圖片，通過(guò)深度反演推算才能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)高分辨三維結(jié)構(gòu)重建。

左：多角度掃描蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)投影；右：二維投影反推三維結(jié)構(gòu)原理

（圖片來(lái)源：參考文獻(xiàn)[7]）

“冷凍”的終極意義：凝固生命的間，解碼自然的精妙

正是這種逼近宇宙極限的極寒，讓我們得以突破觀測(cè)瓶頸，將瞬息萬(wàn)變、脆弱無(wú)比的生物大分子“凍結(jié)”在最接近天然活動(dòng)的狀態(tài)，并以接近原子級(jí)的分辨率解析其復(fù)雜而精妙的三維結(jié)構(gòu)。

從揭示核糖體合成蛋白質(zhì)的機(jī)制，到解析新冠病毒表面刺突蛋白結(jié)構(gòu)以加速疫苗研發(fā)，再到描繪神經(jīng)受體傳遞信號(hào)的奧秘——冷凍電鏡的每一次“定格”與“成像”，都是人類向生命微觀世界最深處發(fā)起的一次叩問(wèn)。它所展現(xiàn)的，不僅僅是人類對(duì)物理意義上絕對(duì)低溫的掌控和應(yīng)用，更是科學(xué)家們發(fā)揮人類智慧突破認(rèn)知疆界的非凡決心。這“冷”的表象之下，涌動(dòng)著的，是對(duì)生命運(yùn)行規(guī)律熾熱的探索渴望。

因此，當(dāng)你再聽(tīng)到下一個(gè)重要的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被成功解析時(shí)，不妨想想那接近絕對(duì)零度的極寒瞬間，那一刻凝固著生命律動(dòng)中最美妙的一幀！

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙明潔,曹端方,章新政.基于冷凍電鏡無(wú)傾轉(zhuǎn)成像數(shù)據(jù)的新型蛋白質(zhì)原位結(jié)構(gòu)解析方法[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2024,51(10):2418-2429.

[2] 劉霞.冷凍電鏡“看清”免疫調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)[N].科技日?qǐng)?bào),2025-06-19(004).

[3] 楊梓,范瀟,王宏偉.應(yīng)用單張冷凍電鏡顯微照片解析近原子分辨率的單顆粒三維重構(gòu)[J].電子顯微學(xué)報(bào),2025,44(01):91-105.

[4] 趙明潔,曹端方,章新政.基于冷凍電鏡無(wú)傾轉(zhuǎn)成像數(shù)據(jù)的新型蛋白質(zhì)原位結(jié)構(gòu)解析方法[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2024,51(10):2418-2429.

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[7] Jacqueline L. S. Milne1, E. Cryo‐electron microscopy - a primer for the non‐microscopist[J]. The FEBS Journal, 2013, 280(1).

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出品：科普中國(guó)

作者：周靖辰（中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)）

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