本文系Food Science and Human Wellness原創(chuàng)編譯，歡迎分享，轉(zhuǎn)載請授權(quán)。

Introduction

肥胖是一種復(fù)雜的多因素疾病，具有過度的肥胖，存在健康風(fēng)險，被認(rèn)為是包括糖尿病，心血管疾病，肌肉骨骼疾病和某些癌癥在內(nèi)的非傳染性疾病的重要危險因素。益生菌被定義為“活的微生物，當(dāng)以足夠的量施用時，會給宿主帶來健康益處”。許多研究報告說，益生菌及其代謝產(chǎn)物（包括乳桿菌，雙歧桿菌和丙酸桿菌）可以抑制脂肪組織中的脂質(zhì)積累。副干酪乳桿菌K56（K56）是從中國上海出生的2歲健康嬰兒的腸道中分離出來的，并且K56的安全性已在體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。它通常被認(rèn)為是安全的（GRAS）。K56已證明具有預(yù)防肥胖的潛力，有效地改善了高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠的糖脂代謝。包括鼠李糖乳桿菌GG（LGG）在內(nèi)的一些益生菌可以通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。細(xì)胞因子在其中起著關(guān)鍵作用。為了評估K56對脂質(zhì)代謝的影響及其潛在機(jī)制，并探討這是否基于益生菌的特定免疫調(diào)節(jié)特性，采用K56或LGG（作為參考）在體外處理RAW264.7巨噬細(xì)胞。接下來，將K56或LGG刺激的RAW264.7條件培養(yǎng)基（K56/LGG-CM）應(yīng)用于3T3-L1前脂肪細(xì)胞的成脂分化。檢測了脂質(zhì)積累程度以及脂肪細(xì)胞的脂肪生成和脂解相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)。檢測了用益生菌激活RAW264.7巨噬細(xì)胞后免疫因子的表達(dá)水平。這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，K56具有與乳桿菌其他益生菌不同的特定糖脂代謝和免疫調(diào)節(jié)模式。

Result and Discussion

K56/LGG刺激的RAW264.7-CM抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)積累和ADP分泌

如圖1A和B的結(jié)果所示，在任何比例下，細(xì)菌菌株對RAW264.7細(xì)胞均無毒性效應(yīng)。如圖1C和D所示的結(jié)果所論證，K56/LGG-CM在任何劑量下均未對3T3-L1細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)。

圖1 RAW264.7細(xì)胞和3T3-L1前脂肪細(xì)胞的相對細(xì)胞活力

將K56/LGG/PGN/LPS與RAW264.7巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，收集來自對照組（Ctrl-CM）的K56/LGG/PGN/LPS刺激的RAW264.7條件培養(yǎng)基（K56/LGG/PGN/LPS-CM）和CM，并在DM1中成脂分化的3T3-L1前脂肪細(xì)胞第0～3天進(jìn)一步處理。將一組沒有CM處理的組設(shè)置為無干預(yù)組（在圖中稱為“無”）。在第6天進(jìn)行油紅O染色后，400倍放大倍率顯微鏡下的圖像（圖2A）顯示，無干預(yù)組的前脂肪細(xì)胞已成功分化為富含脂質(zhì)的球形脂肪細(xì)胞。與Ctrl-CM和無干預(yù)組相比，K56-CM、LGG-CM、PGN-CM和LPS-CM組顯示出較少的成脂分化和脂質(zhì)積累。然而，只有LPS-CM組顯示油紅O溶液的吸光度顯著降低，與3T3-L1細(xì)胞中染色的脂質(zhì)相比，與其他組相比（P＜0.05，圖2B）。與Ctrl-CM組相比，來自3T3-L1脂肪細(xì)胞的ADP分泌在K56-CM、LGG-CM、PGN-CM和LPS-CM組中顯著降低，并且在無干預(yù)組中顯著增加（P＜0.05，圖2C）。同時，K56-CM組的ADP分泌水平顯著低于PGN-CM組，但高于LGG-CM和LPS-CM組（P＜0.05，圖2C）。

圖2 K56/LGG/PGN/LPS刺激的RAW264.7條件培養(yǎng)基（CM）對3T3-L1脂肪細(xì)胞脂質(zhì)積累和ADP分泌的影響

K56/LGG刺激的RAW264.7-CM對3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂肪生成相關(guān)和脂肪生成相關(guān)標(biāo)記物表達(dá)的影響不同

為了確定K56或LGG刺激的RAW264.7-CM抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)積累和ADP分泌的機(jī)制，在脂肪生成分化完成時檢測了3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂肪生成相關(guān)和脂肪生成相關(guān)標(biāo)記物的mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)產(chǎn)生。如圖3A所示，對于晚期脂肪生成相關(guān)標(biāo)記物，PPAR-γ、C/EBP-α和aP-2的mRNA表達(dá)在K56-CM組和Ctrl-CM組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。同時，與LGG-CM和LPS-CM組相比，K56-CM組中C/EBP-α的mRNA表達(dá)也增強(qiáng)了（P＜0.05；圖3A）。此外，與無干預(yù)組相比，K56-CM顯著降低了PPAR-γ和C/EBP-α的蛋白質(zhì)產(chǎn)生，并且與LGG-CM、PGN-CM和LPS-CM組相比，增加了它們的產(chǎn)生（P＜0.05，圖3B）。

如圖3C所示，對于脂肪生成相關(guān)標(biāo)記物，如mRNA表達(dá)水平，用K56-CM處理顯著促進(jìn)了ACC的表達(dá)，與Ctrl-CM和所有其余組相比（P＜0.05），并且在SCD1的表達(dá)上與Ctrl-CM和LGG-CM組相比呈上升趨勢，但顯著低于無干預(yù)組（P＜0.05）。如圖3D所示，脂肪生成相關(guān)標(biāo)記物的蛋白質(zhì)產(chǎn)生為我們提供了更多信息。與Ctrl-CM組相比，K56-CM顯著促進(jìn)了SCD1和甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（SREBP-1）的產(chǎn)生（P＜0.05），但兩組之間在其他指標(biāo)上沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

圖3 K56/LGG/PGN/LPS刺激的RAW264.7-CM對3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂肪生成相關(guān)和脂肪合成相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響

K56刺激的RAW264.7-CM增強(qiáng)了3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂解相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)

如圖4A所示，發(fā)現(xiàn)用K56-CM處理顯著增加了PLIN1和?；?CoA合成酶長鏈家族成員-1（Acsll）（P＜0.05）的mRNA表達(dá)，與Ctrl-CM和所有其他組相比。與此同時，K56-CM還顯著促進(jìn)了與LGG-CM、PGN-CM和LPS-CM組相比的PLIN1和Acsll的mRNA表達(dá)（P＜0.05，圖4A）。與mRNA表達(dá)類似，用K56-CM處理的3T3-L1脂肪細(xì)胞中p-HSL、HSL、ATGL和PLIN1的蛋白質(zhì)產(chǎn)生水平高于Ctrl-CM組（圖4B）。K56-CM組中ATGL和PLIN1的產(chǎn)生水平顯著高于LGG-CM、PGN-CM和LPS-CM組，并且K56-CM顯著促進(jìn)了與LGG-CM和LPS-CM組相比的p-HSL和HSL的產(chǎn)生（P＜0.05，圖4B）。因此，與抑制成脂分化的LGG-CM組不同，K56-CM通過促進(jìn)脂解來減少3T3-L1脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)積累。

圖4 K56/LGG/PGN/LPS刺激的RAW264.7-CM對3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂肪分解相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響

K56刺激的RAW264.7-CM增強(qiáng)了3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂肪酸

與Ctrl-CM和所有其他組相比，用K56-CM處理顯著促進(jìn)了ACOX1、長鏈酰基-CoA脫氫酶（Lcad）和中鏈?；?CoA脫氫酶（Mcad）的mRNA表達(dá)（P＜0.05，圖5A）。除此之外，與Ctrl-CM和所有其他組相比，K56-CM顯著增強(qiáng)了線粒體生物發(fā)生相關(guān)因子（如PGC-1α和核呼吸因子（Nrf）-1）的mRNA表達(dá)（P＜0.05，圖5B）。然而，如圖5C所示，K56-CM組中CPT-1α、ACOX1和PGC-1α的蛋白質(zhì)產(chǎn)生水平與Ctrl-CM和所有其他組相比沒有顯示任何統(tǒng)計學(xué)差異，除了與LPS-CM組相比，CPT-1α的產(chǎn)生顯著降低（P＜0.05）?？傊琄56-CM對脂肪酸

圖5 K56/LGG/PGN/LPS刺激的RAW264.7-CM對3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂肪酸β-氧化相關(guān)及線粒體生物合成相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響

K56/LGG對RAW264.7細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)和分泌的影響不同

用K56處理后，與對照組相比，RAW264.7細(xì)胞中TNF-α的mRNA表達(dá)顯著增加。相反，與LGG或LPS組相比，一些促炎細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-6和IL-1β）的mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖6A、C和I）。K56或LGG處理后，RAW264.7細(xì)胞中IL-10的mRNA表達(dá)水平顯著低于LPS組（P＜0.05；圖6E）。此外，與對照組或PGN組相比，K56處理后RAW264.7細(xì)胞的TNF-α分泌顯著增加，與LGG或LPS組相比則降低（P＜0.05，圖6B）。結(jié)果表明，K56或LGG處理后RAW264.7細(xì)胞中IL-6和IL-10的分泌水平顯著低于LPS組（P＜0.05，圖6D和F）。此外，所有組中IL-12的mRNA表達(dá)沒有差異（圖6G），并且在用K56或LGG處理的RAW264.7細(xì)胞中未檢測到IL-12或IL-1β分泌（圖6H和J）。

圖6 RAW264.7細(xì)胞經(jīng)K56、LGG、PGN或LPS處理后，細(xì)胞因子mRNA表達(dá)及分泌情況

Conclusion

總之，本研究表明，K56和LGG通過免疫介導(dǎo)但機(jī)制不同的方式減少脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)積累。K56刺激巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子（包括TNF-α）的能力弱于LGG。因此，K56條件培養(yǎng)基對脂肪生成、脂肪合成和脂肪分解相關(guān)標(biāo)志物的抑制作用較弱。不同的脂肪分解相關(guān)標(biāo)志物與適當(dāng)水平的TNF-α協(xié)同作用，增強(qiáng)了脂肪酸β-氧化相關(guān)和線粒體生物合成相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，并促進(jìn)了脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)代謝。提示K56可能通過維持宿主免疫穩(wěn)態(tài)來改善糖脂代謝。然而，相關(guān)機(jī)制需要在體外進(jìn)一步研究，通過檢測脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)代謝上游通路的激活以及巨噬細(xì)胞中模式識別受體的特異性極化。

Lacticaseibacillus paracasei K56 inhibits lipid accumulation in adipocytes by promoting lipolysis

Silu Wanga,1, Jinxing Lia,1, Wei-Hsien Liub, Niya Lia, Huijing Lianga, Weilian Hungb, Qiuyue Jiangb, Ruyue Chenga, Xi Shena,*, Fang Hea,*

a Department of Nutrition and Food Hygiene, West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China

b Inner Mongolia Yili Industrial Group Co., Ltd., Hohhot 010110, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Probiotics crosstalk immunity to improve host glycolipid metabolism, which is a new strategy for obesity. This study aimed to explore the functions of Lacticaseibacillus paracasei K56 (K56), in regulating the lipid metabolism of adipocytes and its immune regulation mechanisms. We co-cultured RAW264.7 macrophages with K56, and the K56-stimulated RAW264.7-conditioned medium (K56-CM) was collected and treated with 3T3-L1 pre-adipocytes. The expression of lipid metabolism-related markers of adipocytes, and the content of cytokines in CMs were detected. The results demonstrated that K56-CM promoted the expression of peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ), CCAAT/enhancer binding protein α (C/EBPα), and other adipogenesis-related markers, which resulted in the upregulation of lipolysis markers, such as hormone-sensitive lipase (HSL), adipose triglyceride lipase (ATGL). The activation of lipolysis enhanced the expression of fatty acid β-oxidation-related and mitochondrial biogenesis-related markers and reduced lipid accumulation in adipocytes. The glycolipid metabolism pattern of K56 may be due to its immunomodulatory characteristics, which stimulated macrophages to secrete fewer TNF-α, thereby promoting the expression of lipolysis-related markers, and TNF-α synergized with lipase to promote lipolysis. It has not been reported that L. paracasei modulated lipid metabolism via the lipolysis pathway, which suggested that K56 may regulate glycolipid metabolism of the host by maintaining immune homeostasis.

Reference:

WANG S L, LI J X, LIU W H, et al. Lacticaseibacillus paracasei K56 inhibits lipid accumulation in adipocytes by promoting lipolysis[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(6): 3511-3521. DOI:10.26599/FSHW.2023.9250034.

翻譯： 管勤昊（實(shí)習(xí)）

編輯：梁安琪；責(zé)任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創(chuàng)意

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