嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）療法在血液惡性腫瘤治療中取得了顯著療效。然而，傳統(tǒng)的體外病毒載體介導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)流程耗時(shí)、昂貴，且可能損害T細(xì)胞功能。體內(nèi)生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞是一種新方法，可以避免復(fù)雜的生產(chǎn)過程，通過大規(guī)模生產(chǎn)降低成本，并且相比體外生產(chǎn)更能保護(hù)T細(xì)胞功能。臨床前研究已證明體內(nèi)CAR-T療法在血液惡性腫瘤模型中具有良好的抗腫瘤活性。

《Genes & Diseases》（IF=9.4）近日發(fā)表綜述，描述了體內(nèi)CAR-T細(xì)胞療法的最新進(jìn)展，并討論了其臨床應(yīng)用的潛在挑戰(zhàn)。

傳統(tǒng)體外CAR-T的挑戰(zhàn)

高成本: 個(gè)性化定制（“一患者，一批次”）導(dǎo)致費(fèi)用高昂。

耗時(shí)長:從細(xì)胞采集到回輸通常需要2-3周，可能不適合疾病快速進(jìn)展的患者（這部分需要橋接治療）。

流程復(fù)雜: 涉及白細(xì)胞分離、激活、基因修飾、擴(kuò)增、冷凍、質(zhì)控等多個(gè)步驟，可變性高。

T細(xì)胞功能受損:體外培養(yǎng)和激活過程可能導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭。

需要清淋化療: 輸注前需要進(jìn)行淋巴清除化療，會(huì)增加感染等風(fēng)險(xiǎn)。

體內(nèi)CAR-T的機(jī)遇

“現(xiàn)貨型”產(chǎn)品(Off-the-shelf): 像常規(guī)藥物一樣可隨時(shí)使用，無需等待。

可行性: 納米顆粒等載體已有成熟的GMP生產(chǎn)平臺，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、低成本生產(chǎn)。納米藥物價(jià)格相對低廉，且穩(wěn)定性好。

保留T細(xì)胞功能: T細(xì)胞在體內(nèi)生理環(huán)境中被改造，避免了體外培養(yǎng)的壓力和耗竭。

可能無需清淋化療:體內(nèi)改造的T細(xì)胞處于生理環(huán)境，可能不需要強(qiáng)力的清淋預(yù)處理。

主動(dòng)靶向與持續(xù)作用:相比需要重復(fù)給藥的雙特異性抗體（如貝林妥歐單抗），體內(nèi)產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞可以主動(dòng)靶向腫瘤、自我擴(kuò)增并持續(xù)殺傷。

體內(nèi)生產(chǎn)技術(shù)

病毒載體

慢病毒(LV): 轉(zhuǎn)染效率高，可以穩(wěn)定地將基因插入分裂和非分裂細(xì)胞，攜帶容量大（~10 kb）。研究已成功使用靶向CD3、CD4、CD8的LV在體內(nèi)生成抗CD19、抗CD20等的CAR-T細(xì)胞，并在小鼠模型中顯示出抗腫瘤效果。挑戰(zhàn)包括插入突變風(fēng)險(xiǎn)、免疫原性、靶向特異性（脫靶效應(yīng)）和高成本。

腺相關(guān)病毒(AAV): 安全性較好，免疫原性相對較低，因其低整合率和非致病性而被廣泛使用。已用于體內(nèi)生產(chǎn)抗CD4 CAR-T治療T細(xì)胞白血病。挑戰(zhàn)包括包裝容量有限（~4.4 kb）和仍存在的免疫原性。

非病毒載體 (主要為納米顆粒)

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(mRNA): 通過靶向性納米顆粒（如脂質(zhì)納米顆粒LNP, PBAE聚合物）遞送CAR mRNA。優(yōu)點(diǎn)是無基因組整合風(fēng)險(xiǎn)、表達(dá)快速。但表達(dá)時(shí)間短（約7天），需要重復(fù)給藥才能維持療效。已用于治療心臟纖維化、白血病、前列腺癌等模型。

持久轉(zhuǎn)染(DNA): 通過納米顆粒遞送CAR DNA，并利用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)（如睡美人、PiggyBac）或S/MARs（ scaffold/matrix attachment regions）元件實(shí)現(xiàn)基因組整合或染色體外持久表達(dá)。可避免重復(fù)給藥。挑戰(zhàn)是轉(zhuǎn)染效率通常低于病毒載體，且生產(chǎn)過程需要嚴(yán)格控制以確保批次間穩(wěn)定性。

其他技術(shù): 電穿孔、工程化蛋白（如Cas9 RNP復(fù)合物）等，但也各有其局限（如操作難度、免疫原性）。

挑戰(zhàn)與局限性

安全性: 病毒載體的插入突變風(fēng)險(xiǎn)；非病毒載體的潛在毒性（如陽離子脂質(zhì)）；基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）可能導(dǎo)致的非預(yù)期基因變異（大片段缺失、復(fù)雜重排）。

效率:非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率（尤其是進(jìn)入細(xì)胞核的效率）通常低于病毒載體。低效率可能導(dǎo)致需要重復(fù)給藥或細(xì)胞數(shù)量不足。

靶向性與脫靶效應(yīng):確保載體精準(zhǔn)靶向T細(xì)胞而非其他細(xì)胞類型至關(guān)重要，否則可能導(dǎo)致毒性或療效下降。

免疫原性: 針對病毒載體外殼或外源蛋白（如Cas9）的免疫反應(yīng)可能降低轉(zhuǎn)染效率、清除轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞或影響載體穩(wěn)定性。

生產(chǎn)成本與監(jiān)管: 病毒載體的生產(chǎn)成本和監(jiān)管要求仍然很高。納米顆粒的大規(guī)模生產(chǎn)需要嚴(yán)格的質(zhì)控。

未來展望與策略

靶向整合: 使用CRISPR等基因編輯技術(shù)將CAR基因精準(zhǔn)插入基因組的特定位點(diǎn)（如TRAC, PD-1 locus），以提高安全性和有效性。

非整合DNA載體: 利用S/MARs等元件實(shí)現(xiàn)CAR基因的染色體外持久表達(dá)，完全避免插入突變風(fēng)險(xiǎn)。

聯(lián)合策略:將體內(nèi)CAR-T與其他技術(shù)結(jié)合，如光熱療法、光穿孔技術(shù)提高轉(zhuǎn)染效率、改造CAR-T細(xì)胞（如敲除GM-CSF以減少細(xì)胞因子釋放綜合征CRS）等。

其他CAR免疫細(xì)胞: 探索體內(nèi)生成CAR-NK細(xì)胞、CAR-M（巨噬細(xì)胞）等，這些細(xì)胞在對抗實(shí)體瘤方面可能具有獨(dú)特優(yōu)勢（如更好的浸潤性、克服免疫抑制微環(huán)境）。

細(xì)胞膜包被納米顆粒: 利用同源靶向和免疫逃逸功能提高遞送效率和減少脫靶效應(yīng)。

總結(jié)

體內(nèi)生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞療法因其簡化流程、降低成本、“現(xiàn)貨”可用等巨大優(yōu)勢而備受關(guān)注，有望讓更廣泛的患者群體受益。盡管在臨床前研究中取得了鼓舞人心的成果，但其安全性、轉(zhuǎn)染效率和臨床療效仍需進(jìn)一步提高。通過開發(fā)靶向整合/非整合策略、聯(lián)合治療以及探索其他CAR免疫細(xì)胞等方法，有望克服當(dāng)前挑戰(zhàn)，推動(dòng)體內(nèi)CAR-T療法走向臨床現(xiàn)實(shí)。

參考文獻(xiàn)

Genes Dis . 2025 Mar 25;12(6):101612. doi: 10.1016/j.gendis.2025.101612.

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