“我們成功研發(fā)了世界上第一例固載化的類核糖體分子反應(yīng)器（RMMR，Ribosome-Mimicking Molecular Reactor），并一舉攻克了結(jié)構(gòu)中含有多個密集 N-Me 氨基酸或 α,α-二取代氨基酸的高空間位阻多肽的高效固相合成和自動化機器合成技術(shù)?！蹦暇┐髮W(xué)教授姚祝軍告訴 DeepTech。

圖 | 姚祝軍（來源：姚祝軍）

可能是幾十年來 SPPS 領(lǐng)域為數(shù)不多的重大突破之一

很多人都知道，生物學(xué)“中心法則”中 RNA 翻譯到蛋白質(zhì)這一過程發(fā)生在核糖體。翻譯時，核糖體小亞基先與從細胞核中轉(zhuǎn)錄得到的信使 RNA 結(jié)合，讀取 mRNA 信息再結(jié)合核糖體大亞基構(gòu)成完整的核糖體，將轉(zhuǎn)運 RNA 運送的氨基酸分子合成多肽。在本次研究中，該團隊把核糖體視作一架巨大的多肽制造“分子機器”，經(jīng)不斷的思考、討論和修正，逐步形成了一種“跳出傳統(tǒng) Merrifield SPPS 習(xí)慣思維”的新思路：即模擬核糖體的蛋白質(zhì)翻譯過程，使類似的“肽?！焙汀鞍滨?tRNA”單元相互靠近并發(fā)生分子內(nèi)“ON”?；D(zhuǎn)移而形成目標肽鍵，克服現(xiàn)有 SPPS 技術(shù)在反應(yīng)原理上掙扎的效率困境。

RMMR 分子反應(yīng)器包含兩個關(guān)鍵部分：一個多肽合成把手區(qū)（模擬肽酰 tRNA）和數(shù)個?；罨瘏^(qū)（模擬氨酰 tRNA）。將其固定至商用樹脂表面即成為可循環(huán)運作的反應(yīng)平臺。RMMR SPPS 通過 RMMR 反應(yīng)平臺進行氨基酸活化并快速與多肽鏈 N 端氨基發(fā)生“偽均相”酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從根源上解決了傳統(tǒng) SPPS 兩相間?；D(zhuǎn)移的低效率問題。這種由可循環(huán)工作的分子機器實施的目標肽鍵形成方案，就像換了一個賽道完全顛覆了傳統(tǒng) Merrifield SPPS 合成的工作原理和反應(yīng)模式。同時，這種迭代 RMMR 方法也承接了傳統(tǒng) SPPS 在氨基酸活化酯方面的部分成就，賦予其操控反應(yīng)的“開/關(guān)”控制：商用的 N-Fmoc 氨基酸與溫和廉價縮合劑 DIC 所形成的活性中間體將 RMMR 樹脂上的活化功能區(qū)“turn on”，隨后根據(jù)空間鄰近效應(yīng)介導(dǎo)發(fā)生分子反應(yīng)器“內(nèi)/間”快速?；D(zhuǎn)移，從而形成目標酰胺鍵；而那些前一流程未被反應(yīng)掉的活化功能區(qū)則在隨后哌啶處理支載多肽末端 N-Fmoc 保護基的同時也被“turn off”，準備好迎接下一輪氨基酸的縮合循環(huán)。這一過程不僅可以實現(xiàn)高度的可重復(fù)運作，而且操控十分簡單，因此適配于自動化多肽合成平臺。

（來源：Nature Chemistry）

實驗結(jié)果表明，RMMR SPPS 方法能以高至 98% 的效率合成含 N-甲基和 α，α-雙取代兩類大位阻氨基酸的多肽序列。在多種常見的 N-甲基氨基酸/α，α-雙取代氨基酸位置前后均可高效縮合不同性質(zhì)的氨基酸，前/后相對位置不影響縮合效率；同時，序列中可連續(xù)或非連續(xù)地高效縮合多個大位阻氨基酸。該方法還首次實現(xiàn)了同時存在兩種類型大位阻氨基酸的多肽序列的高效縮合，并以 90% 效率完成了難度極大的“Aib-NMeVal”型酰胺鍵的形成。

此次新技術(shù)在多種具有重要生理活性的大位阻多肽天然產(chǎn)物的固相合成中展現(xiàn)出色優(yōu)勢。例如，采用 RMMR SPPS 的 cyclosporin A 類似物合成范例顯示，其中含有 7 個 N-Me 氨基酸的鏈狀 11 肽粗產(chǎn)品的純度可達 88%，分離純化產(chǎn)率可達 70%，大大超越了現(xiàn)有文獻報道的結(jié)果。范例中還包括了抗菌肽 alamethicin F 衍生物的 RMMR SPPS，該二十肽序列中包含了八個 α-甲基丙氨酸（Aib）殘基，其機器自動化合成的粗產(chǎn)品純度可達 88%，分離純化后產(chǎn)率為 73%，結(jié)果相當(dāng)驚艷。

總而言之，RMMR SPPS 創(chuàng)新技術(shù)籍由迭代科學(xué)思維，突破了 60 多年來傳統(tǒng)固相多肽合成法無法克服的原理性限制，實現(xiàn)了溫和條件下高空間位阻難合成肽鏈的高效組裝，是一項在多肽固相合成和自動化合成領(lǐng)域具有里程碑意義的重大突破。RMMR SPPS 技術(shù)可望極大加速含有 N -甲基化和 α，α-雙取代氨基酸的多肽藥物探索，為未來口服及作用于細胞內(nèi)靶點的肽類藥物候選分子的發(fā)現(xiàn)和生物相容性材料的研究開發(fā)帶來重大突破機遇。

審稿人評價稱：“該概念簡單且巧妙，依賴于一種量身定制的聚合物固體支持物，其中樹枝狀四價 HOBt 或 Oxyma? 衍生物被接枝到固體支持物的上游，用于錨定和延長待延伸的肽鏈的可裂解連接體。HOBt 衍生物和 Oxyma? 都是經(jīng)典添加劑（或偶聯(lián)劑如 HBTU 或 COMU 等許多其他偶聯(lián)劑的亞組分），用于形成氨?；罨ィ@些活化酯是當(dāng)前大多數(shù) SPPS 方案中酰胺形成偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)物，通過 O-N 酰基轉(zhuǎn)移從溶液相轉(zhuǎn)移到生長肽鏈的固體支持胺中?！?/p>

審稿人還表示：“與使用傳統(tǒng) SPPS 方案相比，結(jié)果絕對令人震驚且具有說服力，當(dāng)合成的肽含有 N-甲基化或季銨氨基酸時，其粗品純度得到了顯著且大幅度的提升。在我看來，這極有可能是幾十年來 SPPS 領(lǐng)域為數(shù)不多的重大突破之一，其技術(shù)突破程度或許可與 Fmoc-SPPS 的發(fā)明或 ChemMatrix、PEGA 等極性樹脂的開發(fā)相媲美。從這個意義上說，我認為這一新概念的發(fā)明非常具有價值且值得在Nature Chemistry這一頂尖化學(xué)期刊上發(fā)表?！?/p>

姚祝軍表示，RMMR SPPS 不僅可以高效合成各種高空間位阻多肽，而且全面兼容現(xiàn)有 Merrifield SPPS 涉及的所有工作范圍，包括自動化儀器平臺，這兩種技術(shù)在操作中還可以實現(xiàn)自由切換使用。因此，RMMR SPPS 的原理與技術(shù)在一定意義上可以稱作是新一代或迭代固相合成技術(shù)。

RMMR SPPS 新技術(shù)將會在以下幾個方面帶來巨大機遇：1）肽藥設(shè)計的范圍將被拓展，將能觸及到以前不可能獲得的化合物禁區(qū)；2）現(xiàn)有具有先天缺陷的肽藥將獲得新的優(yōu)化機會，比如提升藥物口服利用度等；3）賦予研究者逐鹿肽類藥物跨膜靶向胞內(nèi)受體的各種機會；4）能夠融合 AI 技術(shù)研制新一代 SPPS 自動化合成（實驗室）儀器平臺。

（來源：Nature Chemistry）

惡名昭著的頭號“難肽”

多肽和蛋白質(zhì)是生命體最重要的基礎(chǔ)物質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)由各個氨基酸通過肽鍵（酰胺鍵）依次相連而形成。由于分子內(nèi)和分子間的氫鍵等非鍵相互作用而發(fā)生局部結(jié)構(gòu)扭轉(zhuǎn)或形成折疊，最終成為各式各樣具有不同三維結(jié)構(gòu)的生理功能物質(zhì)。肽類藥物因其生物相容性等優(yōu)勢近年來受到重點關(guān)注且發(fā)展迅速，但同時也受到其固有的代謝穩(wěn)定性和透膜性差的嚴重制約。研究顯示，在肽骨架中引入 N-甲基或 α-烷基化氨基酸可明顯改善化學(xué)穩(wěn)定性和膜通透性，從而增強肽類化合物的“成藥性”。當(dāng)今風(fēng)靡全球的降糖減重藥物“司美格魯肽（Semaglutide）”就是天然的人胰高糖素樣肽-1（GLP-1，glucagon-like peptide-1）的結(jié)構(gòu)修飾物，其中的化學(xué)改造就包括在結(jié)構(gòu)中插入了一個 α-烷基化氨基酸（Aib,U）來延長代謝半衰期，由于效果極為明顯其成為了一例新型長效的胰高糖素樣肽-1 受體激動劑，被用于了成人 2 型糖尿病患者的血糖控制。

當(dāng)前，絕大多數(shù)的多肽都可通過美國著名生物化學(xué)家布魯斯·梅里菲爾德（Bruce Merrifield）于 1963 年首創(chuàng)發(fā)明的多肽固相合成法（SPPS，solid-phase peptide synthesis）制備獲得，且可實現(xiàn)工業(yè)規(guī)模的自動化機器合成。Merrifield 因此也獲得 1984 年諾貝爾化學(xué)獎。但是，Merrifield SPPS 固液兩相間的傳質(zhì)效率十分低下，導(dǎo)致關(guān)鍵的?；D(zhuǎn)移動力學(xué)性質(zhì)較差，在技術(shù)上每步都需要使用大大過量的化學(xué)試劑和活化劑來幫助反應(yīng)效率達標，經(jīng)濟性和綠色化學(xué)目標都非常不佳。并且，Merrifield SPPS 方法無法實現(xiàn)上述二類空間大位阻多肽序列的合成。過去六十多年間，一代又一代科研學(xué)者通過前赴后繼的努力提供了無數(shù)的改進方案，均無法獲得突破，空間大位阻多肽的固相合成成為多肽合成化學(xué)領(lǐng)域惡名昭著的頭號“難肽”。該合成化學(xué)層面的長期困惑嚴重制約了現(xiàn)代新藥研究和藥物工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的前行步伐。為了解決這一問題，該團隊開展了本次研究。

（來源：Nature Chemistry）

多肽合成化學(xué)“拔釘子”行動

據(jù)介紹，2019 年春由該團隊的劉發(fā)博士和姚祝軍作為課題發(fā)起人開始討論多肽合成中公認的幾個難題，該團隊稱之為多肽合成化學(xué)“拔釘子”行動。第一個目標就是大空間位阻多肽的肽鍵形成問題。他們認為傳統(tǒng)技術(shù)的優(yōu)化通道很窄，六十多年來有可能的改進都應(yīng)該被研究過了，結(jié)論是至今無法突破。因此，該團隊認為必須換思路、換賽道，于是開始有了模擬核糖體功能的想法。最后形成了類核糖體方案，提出了分子機器的概念。2019 年 9 月，魏思媛同學(xué)（本次論文第一作者）從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)作為五年制免試直博生來南京大學(xué)報到，課題才正式開始啟動?！捌陂g，魏思媛同學(xué)展示了超強的學(xué)習(xí)和領(lǐng)悟能力、實驗動手能力和結(jié)果分析能力，以及作為湖南妹子的堅忍和毅力。在她的不懈努力下，‘關(guān)關(guān)難過關(guān)關(guān)過’，最終課題獲得全面突破?！币ψ＼姳硎?。

隨后，他們在分子設(shè)計階段拿出了好幾套潛在方案，但其實他們并沒有能力判斷哪一種是最好的，只好由魏思媛自己挑一套開始?！坝浀盟鋈粺o措了好幾天，決定像摸彩票?！币ψ＼娀貞浄Q。由于目前的理論性預(yù)測能力不足以支持前期預(yù)判，堆積“搬磚”工作量是唯一的途徑。每一批數(shù)據(jù)出來之后，他們都要仔細分析規(guī)律，隨后針對設(shè)計進行了一次次優(yōu)化，然后繼續(xù)驗證……這個過程非?？简炚n題組的耐心，很多數(shù)據(jù)在出現(xiàn)時非常無序，他們的心情也隨之高低起伏，有時候晚上焦慮實驗結(jié)果而睡不著覺。經(jīng)過四輪優(yōu)化，終于獲得了比較滿意且符合規(guī)律的結(jié)果。“預(yù)期的分子機器概念曙光乍現(xiàn)，感覺像要開啟成功之門了?！币ψ＼娬f道。

接著，他們把經(jīng)過優(yōu)化之后的固載化 RMMR 分子機器用于“開/關(guān)”操作的動力學(xué)行為研究，確認了可操作性。然后，經(jīng)過設(shè)定實驗的對比，驗證了類核糖體的?；D(zhuǎn)移機制的真實存在；RMMR SPPS 具備普通多肽、長肽的合成能力，并與傳統(tǒng) SPPS 效果相當(dāng)。然后，他們選擇個別代表性高空間位阻多肽進行合成，并與傳統(tǒng) SPPS 進行了效果比較。結(jié)果非常令人欣慰，RMMR SPPS 顯示出驚人的合成優(yōu)勢，甚至超越了該團隊的預(yù)期。到此，該團隊感覺他們已經(jīng)勝利在望，或者已經(jīng)處在“開創(chuàng)新紀元”的征程之中。隨后的底物擴展性研究也非常順利，范例一次次證明 RMMR SPPS 的驚人優(yōu)勢效果；機器自動化合成也非常順利?！拔核兼潞蛷埿旒兺瑢W(xué)自己修訂了商品化儀器設(shè)備自帶的程序包，在實驗范例研究中獲得了優(yōu)異的效果。”姚祝軍回憶稱。

與此同時，在檢驗氨基酸消旋化程度的過程中，他們一度發(fā)現(xiàn)新方法在耦合組氨酸 His 時發(fā)生較為明顯的消旋化，比傳統(tǒng) SPPS 要高出不少，顯然這是非常不利的結(jié)果。為此，他們花了不少時間做各種嘗試，最終發(fā)現(xiàn) RMMR SPPS 和 Merrifield SPPS 條件之間是可以隨意切換的，并不影響氨基酸耦合的效果。如此一來，他們采用按需切換條件的方式不僅解決了 His 偶聯(lián)中少量消旋化的問題，還進一步展示了新技術(shù)的變通性和易操作性?！八^，研究中出現(xiàn)的異常往往是又一次新的發(fā)現(xiàn)機會?！币ψ＼姳硎尽Ｍ瑫r，該團隊也為本次新技術(shù)申請了中國發(fā)明專利和國際專利的知識產(chǎn)權(quán)保護。

（來源：Nature Chemistry）

前面提到，研究者的毅力和堅持對于課題的成功是十分關(guān)鍵的因素。研究過程中大多數(shù)時間都是令人失望的結(jié)果，尤其在本次研究的初期充斥著體力和精神的雙重煎熬。魏思媛（現(xiàn)已經(jīng)博士畢業(yè)）在 2023 年秋季和姚祝軍曾有過一次交流，那時研究工作大體已經(jīng)成型，但尚需要征服個別公認的“硬骨頭”，比如含有密集 N-Me 氨基酸的環(huán)肽藥物——環(huán)孢菌素 A 的 RMMR SPPS 合成，如能攻克則可提升這一方案的科學(xué)高度?！暗@樣的話，她就有可能無法參加原定于 2024 年 5 月組織的畢業(yè)答辯。她希望就此打住。我拒絕了這一請求，并希望她突破這一難題。她當(dāng)時情緒很大，半夜向父母哭訴，把她父母嚇壞了……最終，她還是堅持住了，調(diào)整情緒投入到工作中。后來的實驗工作表明，這一難肽的合成工作并沒有想象中的艱難，RMMR SPPS 像一把神器，迅速破解了這一難題。”姚祝軍表示。后來，魏思媛順利按時完成了畢業(yè)論文答辯，并獲得了答辯專家組全優(yōu)的高度評價。“我也希望以此與讀者們一起共勉，原創(chuàng)性研究工作不僅考驗著研究者的智慧和實踐能力，更考驗導(dǎo)師和學(xué)生的精神毅力?！币ψ＼娍偨Y(jié)稱。

最終，相關(guān)論文以《固定酰基轉(zhuǎn)移分子反應(yīng)器可實現(xiàn)空間受阻肽的固相合成》（Immobilized acyl-transfer molecular reactors enable the solid-phase synthesis of sterically hindered peptides）為題發(fā)在Nature Chemistry，姚祝軍和劉發(fā)擔(dān)任共同通訊作者 [1]。

圖 | 相關(guān)論文（來源：Nature Chemistry）

如前所述，該團隊最初的開題討論瞄準了幾個長久沒有克服的多肽領(lǐng)域合成化學(xué)難題，他們自己將這調(diào)侃為多肽合成化學(xué)的“拔釘子”行動。在開創(chuàng) RMMR SPPS 概念并突破空間大位阻多肽的固相合成與自動化合成之后，他們希望進一步深化和延伸，爭取拔除第二枚著名的”釘子”——易簇集多肽的固相自動化合成及產(chǎn)品分離純化難題。二者的原理有所不同，但現(xiàn)有 RMMR SPPS 經(jīng)變通發(fā)展有望解決第二個難題；目前，該團隊這方面也已經(jīng)取得了部分的階段性進展。此外，該團隊也在布局利用 RMMR SPPS 技術(shù)設(shè)計制造新型雜合形式的高空間位阻多肽，以達到優(yōu)秀的細胞膜透性和代謝穩(wěn)定性。所有這些努力將續(xù)寫迭代 RMMR SPPS 的技術(shù)威力，以拓展具有重要生理學(xué)意義的多肽的自動化合成版圖助力現(xiàn)代肽藥研究。

參考資料：

1.Wei, S., Zhang, X., Yang, X. et al. Immobilized acyl-transfer molecular reactors enable the solid-phase synthesis of sterically hindered peptides.Nat. Chem.(2025). https://doi.org/10.1038/s41557-025-01896-8

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