本文系Food Science and Human Wellness原創(chuàng)編譯，歡迎分享，轉(zhuǎn)載請(qǐng)授權(quán)。

Introduction

麥角硫因（EGT）是一種有效的組氨酸衍生抗氧化劑，具有多種保護(hù)特性，如神經(jīng)保護(hù)、細(xì)胞保護(hù)和DNA端粒的保護(hù)作用。EGT可以由多種微生物合成，包括真菌，如粗神經(jīng)孢子菌和某些絲狀真菌、酵母、放線菌和某些藍(lán)藻。在之前的研究中，評(píng)估了EGT的抗衰老潛力，發(fā)現(xiàn)EGT在雌性和雄性果蠅中都有延長(zhǎng)壽命的作用，而不會(huì)影響雌性果蠅的生殖能力。此外，發(fā)現(xiàn)EGT的抗衰老作用依賴(lài)于果蠅腸道微生物的存在。最近有研究報(bào)道EGT對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎有緩解作用，因此推測(cè)EGT的壽命延長(zhǎng)機(jī)制也可能與衰老果蠅腸道微生物、腸道屏障完整性和腸道形態(tài)的改變有關(guān)。黑腹果蠅模型為研究生物活性物質(zhì)及其對(duì)腸道微生物組成的可能影響之間的關(guān)系提供了一種綜合方法。腸道微生物組成和密度隨蠅的發(fā)育階段和年齡而變化。因此，在本研究中，研究了EGT的抗衰老特性是否與其對(duì)果蠅腸道微生物多樣性、組成和腸道屏障的影響有關(guān)。

Results and Discussion

EGT未引起30日齡果蠅微生物群組成的變化

為了評(píng)估EGT對(duì)腸道微生物群的影響，本研究使用宏基因組測(cè)序分析了30日齡對(duì)照組（n≥160）和EGT處理果蠅（n≥160）的解剖腸道樣本。宏基因組測(cè)序結(jié)果顯示，未處理對(duì)照和EGT處理果蠅的腸道微生物群組成與先前對(duì)果蠅的研究基本一致。變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是果蠅腸道微生物群的主要組成部分（圖1a和b）。在所有腸道樣本中，果蠅內(nèi)共生菌沃爾巴克氏菌的豐度都很低（圖1a和b）。也有大量的細(xì)菌分類(lèi)群只占少數(shù)序列分配，這些細(xì)菌分類(lèi)群在果蠅腸道中可能并不普遍，這反映了腸道微生物的多樣性。

圖1 在中年果蠅中未檢測(cè)到微生物群組成的變化

在屬水平上，所有腸道樣本中醋酸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、魏塞爾氏菌屬、埃希氏菌屬、乳酸桿菌屬和鏈霉菌屬占主導(dǎo)地位（圖1a和b）。在30日齡未處理的對(duì)照組和經(jīng)EGT處理的果蠅之間，未檢測(cè)到門(mén)、科或?qū)俚呢S度差異顯著。此外，對(duì)Chao1和Shannon的物種豐富度和多樣性檢測(cè)顯示，未處理的對(duì)照與EGT處理的蠅類(lèi)間無(wú)顯著差異。利用β-多樣性分析評(píng)估各組之間潛在的群落水平差異，該分析考慮了每個(gè)組的實(shí)際細(xì)菌組成。此外，主坐標(biāo)分析（PCoA）顯示各組間無(wú)顯著差異。因此，EGT介導(dǎo)的黑腹龍壽命延長(zhǎng)與腸道菌群組成的改變無(wú)關(guān)。

EGT誘導(dǎo)果蠅腸道微生物群的變化

從圖2a和n中可以看出，隨著年齡的增長(zhǎng)，兩組的細(xì)菌負(fù)荷均明顯增加，但EGT處理的蠅體細(xì)菌總量低于未處理的對(duì)照組。因此，對(duì)果蠅施用EGT可減少衰老果蠅的細(xì)菌負(fù)擔(dān)。

由于宏基因組測(cè)序只分析了30日齡果蠅中腸的腸道微生物，因此本研究使用類(lèi)群特異性16S qPCR引物進(jìn)行RT-qPCR，進(jìn)一步探討EGT對(duì)果蠅細(xì)菌種群動(dòng)態(tài)的影響。與10日齡的果蠅相比，僅飼喂SYA食物的果蠅的α變形菌、桿菌和γ變形菌的水平隨著年齡的增長(zhǎng)而顯著增加。30日齡和50日齡EGT處理的果蠅在中后期γ變形桿菌和芽胞桿菌的水平有小幅且不顯著的升高。中年果蠅變形桿菌水平顯著升高。EGT處理后的果蠅體內(nèi)γ變形桿菌和芽胞桿菌的動(dòng)態(tài)變化相對(duì)穩(wěn)定（圖2b-d）。

在屬水平上，從第10天開(kāi)始，所有蒼蠅樣本中葡萄糖桿菌和腸球菌的水平都有所增加（圖2e和f），在未處理的對(duì)照組和飼喂EGT的蒼蠅中，10日和50日齡的蒼蠅中腸球菌的水平存在顯著差異（P＜0.05）（圖2e）。無(wú)論實(shí)際年齡如何，未經(jīng)治療的對(duì)照組中葡萄糖桿菌的水平與EGT飼養(yǎng)的蒼蠅中發(fā)現(xiàn)的水平相似（P＜0.05）（圖2f）。

在乳酸菌屬中，除了果狀乳桿菌外，短乳桿菌和植物乳桿菌在未經(jīng)處理的對(duì)照組中水平也發(fā)生了顯著變化。L. plantarum在30日齡時(shí)蠅類(lèi)數(shù)量達(dá)到高峰，50日齡時(shí)突然下降。在50日齡的對(duì)照蠅中，短乳桿菌的水平增幅最大。在含有EGT的食物中飼養(yǎng)的果蠅中，與10日齡的幼蠅相比，在中老年果蠅中觀察到細(xì)菌水平顯著增加（圖2g-j）（P＜0.05）。利用這些數(shù)據(jù)結(jié)合宏基因組測(cè)序結(jié)果，注意到EGT對(duì)50日齡果蠅腸道微生物群的影響最大，對(duì)10日齡和30日齡果蠅的影響很小或沒(méi)有影響。此外，定量PCR分析結(jié)果表明，細(xì)菌種群的波動(dòng)發(fā)生在未經(jīng)處理的果蠅的整個(gè)生命周期中，特別是在中晚期。EGT喂養(yǎng)的衰老果蠅的腸道微生物數(shù)量變化非常穩(wěn)定（圖2g-j）。

圖2 使用（a）通用引物和（b-m）分類(lèi)群特異性引物在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)用16S qPCR檢測(cè)細(xì)菌水平;（n）在EGT-0和100 μm環(huán)境中飼養(yǎng)的雌蠅瓶的菌落形成單位

EGT改善衰老果蠅腸道形態(tài)

采用顯微鏡檢測(cè)方法監(jiān)測(cè)10日齡和50日齡果蠅腸道中活性氧（ROS）水平和上皮損傷。結(jié)果顯示，與10日齡的幼蠅相比，50日齡未處理的對(duì)照和EGT處理的果蠅中腸長(zhǎng)度明顯縮短，收縮，并出現(xiàn)黑色素瘤（圖3a-i）。但EGT喂養(yǎng)的果蠅腸道損傷要比年齡匹配的未治療對(duì)照果蠅輕得多。綜上所述，這些結(jié)果表明果蠅的衰老伴隨著腸道的明顯黑化，EGT的施用限制了衰老果蠅腸道黑色素瘤的生長(zhǎng)。

另外，選取果蠅中腸進(jìn)行7-AAD和DAPI染色，觀察腸上皮細(xì)胞的死亡情況。如圖3k和j所示，與10日齡的幼蠅相比，50日齡的果蠅中7-AAD信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度顯著增加。與單獨(dú)飼喂SYA食物的50日齡果蠅相比，添加EGT的老齡果蠅的7-AAD信號(hào)強(qiáng)度降低（P＜0.01）（圖3k）。

在健康受損的生物體中，經(jīng)常觀察到ROS合成和消除失衡。而由此引起的氧化還原狀態(tài)升高和應(yīng)激反應(yīng)途徑的激活降低了生物體的適應(yīng)度，進(jìn)一步加速了生物體的死亡。因此，通過(guò)DHE染色評(píng)估果蠅中部腸道的氧化還原狀態(tài)，來(lái)測(cè)試攝入抗氧化劑EGT是否可以減少腸道中與年齡相關(guān)的氧化損傷。結(jié)果如圖31和圖m所示。DHE染色的熒光顯微鏡圖像（紅色）顯示，與10日齡的幼齡果蠅相比，衰老果蠅中ROS的含量顯著增加。EGT的攝入降低了ROS水平

圖3 麥角硫因治療改善了果蠅的腸道形態(tài)，延長(zhǎng)了成年期的壽命并保持了腸道功能

EGT可減少果蠅年齡性屏障功能衰竭

對(duì)10日齡和50日齡果蠅解剖腸道中富含絲狀肌動(dòng)蛋白的微絨毛（F-肌動(dòng)蛋白）進(jìn)行了phalloidin染色。如圖4a-d所示，在50日齡未處理的對(duì)照蠅的解剖腸中，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白明顯失調(diào)。在10日齡幼齡果蠅腸上皮細(xì)胞中，具有完整連續(xù)線條的F-actin在細(xì)胞周?chē)幸?guī)律分布，排列整齊，與細(xì)胞緊密相連，無(wú)明顯間隙（圖4a-d）。與年輕果蠅相比，衰老果蠅的所有腸道樣本中都觀察到F-肌動(dòng)蛋白受損，在未經(jīng)治療的對(duì)照組中檢測(cè)到最嚴(yán)重的損傷（圖4e-h）。在未處理的果蠅中，腸道F-肌動(dòng)蛋白排列紊亂，細(xì)胞外周邊緣明顯萎縮，外周細(xì)胞輪廓模糊，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白嚴(yán)重?cái)嗔押蛽p傷（圖4e-h）。相比之下，EGT處理的果蠅腸道F-肌動(dòng)蛋白損傷較?。▓D4i-l）。以上結(jié)果反映衰老誘導(dǎo)腸道F-肌動(dòng)蛋白的重組和異常分布增加了腸上皮細(xì)胞的通透性，EGT增強(qiáng)了F-肌動(dòng)蛋白的修復(fù)，從而維持了衰老果蠅腸道的完整性。

EGT維持了幼蠅緊密連接蛋白的轉(zhuǎn)錄水平。ELISA結(jié)果顯示，與10日齡的幼蠅相比，對(duì)照蠅在中晚期腸道粘蛋白明顯減少（圖4i）。令人感興趣的是，EGT處理的果蠅在中年時(shí)腸粘蛋白水平顯著降低，但EGT使50日齡果蠅的腸粘蛋白水平恢復(fù)到10日齡（P＜0.05）。

圖4 EGT處理老齡蠅介導(dǎo)腸道屏障保護(hù)

EGT可減輕衰老果蠅腸上皮細(xì)胞的損傷

EGT對(duì)腸道屏障具有保護(hù)作用，這促使試驗(yàn)研究EGT在維持和調(diào)節(jié)腸道上皮形態(tài)中的潛在作用。為此，本研究采用高分辨率透射電鏡觀察了幼齡（10日齡）和50日齡（抗生素處理、未處理對(duì)照和EGT處理）果蠅腸上皮的超微結(jié)構(gòu)。抗生素治療可有效抑制腸道細(xì)菌的惡性擴(kuò)張，延緩老年性IBD的發(fā)生，降低腸上皮細(xì)胞的免疫激活，最終延長(zhǎng)果蠅的壽命。因此，本研究利用先前發(fā)表的一種抗生素治療來(lái)控制成年后10日的腸道細(xì)菌生長(zhǎng)，并將抗生素用于蒼蠅作為陽(yáng)性對(duì)照。圖6-9分別顯示了10日齡和50日齡未處理蒼蠅、50日齡EGT飼養(yǎng)蒼蠅和抗生素處理蒼蠅的腸道代表性圖像。

年輕果蠅中腸上皮的完整超微結(jié)構(gòu)

10日齡幼蠅中腸內(nèi)可見(jiàn)核膜完整的腸上皮細(xì)胞，微絨毛分布均勻致密，線粒體正常，嵴結(jié)構(gòu)清晰，矩陣染色均勻。此外，腸壁肌纖維豐富，排列高度規(guī)則，表明幼蠅腸道健康完整（圖5）。

圖5 10日齡未處理蠅（對(duì)照）內(nèi)臟代表性電鏡圖像

抗生素治療明顯修復(fù)了衰老果蠅的腸上皮

在50日齡抗生素處理的果蠅中，觀察到相對(duì)輕微的上皮細(xì)胞損傷。上皮細(xì)胞核膜不完整，部分膜模糊。部分核膜模糊提示核膜破裂。線粒體結(jié)構(gòu)正常，但線粒體矩陣顏色變淺。此外，與年輕的果蠅相比，腸壁的肌肉纖維似乎沒(méi)有那么規(guī)律地排列。上皮細(xì)胞微絨毛缺失不明顯，排列松散。在細(xì)胞內(nèi)觀察到大量的自噬體（圖6f），而在幼齡果蠅的中腸中是不存在的（圖5）。腸上皮細(xì)胞中自噬體數(shù)量的增加可能表明衰老果蠅的中腸中自噬被激活。衰老個(gè)體自噬的重新激活是細(xì)胞正常功能的必要條件。用抗生素治療老年果蠅，基本上恢復(fù)了年輕果蠅的腸道上皮結(jié)構(gòu)（圖6）。

圖6 抗生素處理保存了老齡果蠅腸上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

在未治療的衰老果蠅中檢測(cè)到腸上皮的破壞性損傷

50日齡未經(jīng)處理的對(duì)照組中腸上皮細(xì)胞發(fā)生了明顯的異常細(xì)胞變化（圖7），包括核膜模糊，細(xì)胞核明顯折疊和嚴(yán)重丟失，以及嚴(yán)重的線粒體異常，這些都是細(xì)胞功能障礙的特征。線粒體形態(tài)異常包括嚴(yán)重的矩陣空泡化，嵴腫脹，線粒體腫脹，矩陣淺染。除此之外，上皮細(xì)胞的微絨毛排列松散，變薄（圖7d）。腸壁肌纖維排列明顯疏松，部分腸壁肌肉脫落（圖7e）。與抗生素處理的果蠅（圖6f）相比，在未處理的衰老果蠅中也觀察到自噬體的出現(xiàn)，但數(shù)量較少（圖7f）。

圖7 50日齡未處理果蠅的腸上皮出現(xiàn)明顯損傷

EGT可適度恢復(fù)衰老果蠅的腸上皮

與幼齡果蠅相比，50日齡EGT處理果蠅的中腸中觀察到輕微的上皮細(xì)胞異常，包括核膜輕微模糊，核膜的一小部分丟失（圖8b），線粒體形狀不規(guī)則。上皮細(xì)胞未見(jiàn)明顯線粒體空泡化。微絨毛排列松散，變細(xì)變小，部分微絨毛缺失。腸壁肌纖維紊亂松散，但未見(jiàn)肌纖維丟失。在所有50日齡蠅樣本的中腸上皮細(xì)胞中均觀察到自噬體。EGT組果蠅自噬體數(shù)量最多，抗生素組次之，衰老組最少。此外，經(jīng)EGT處理的果蠅的自噬體呈簇狀結(jié)構(gòu)，似乎包裹了功能失調(diào)的細(xì)胞成分（圖8f）。

圖8 EGT適度維持50日齡果蠅腸道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)

總之，與10日齡的幼蠅相比（圖5），在50日齡的果蠅中腸中觀察到不同程度的輕度至重度細(xì)胞損傷。50日齡未給藥果蠅的上皮細(xì)胞中核膜、細(xì)胞核和線粒體異常最為嚴(yán)重，其次是EGT處理的果蠅和抗生素處理的果蠅。EGT和抗生素的單獨(dú)治療適度維持了線粒體的正常結(jié)構(gòu)，沒(méi)有觀察到嚴(yán)重的矩陣空泡化。在腸壁肌肉方面，只有抗生素治療對(duì)衰老蠅肌纖維的恢復(fù)達(dá)到了幼蠅的程度。無(wú)論補(bǔ)充EGT還是抗生素雞尾酒，衰老果蠅的中腸均檢測(cè)到微絨毛損傷，且EGT處理的果蠅微絨毛損傷嚴(yán)重得多。綜上所述，透射電鏡觀察結(jié)果表明，抗生素治療和EGT治療對(duì)維持果蠅腸道屏障完整性和中腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)有效，是目前研究中效果最好的抗生素治療。

Geroprotection from ergothioneine treatment in Drosophila melanogaster by improving intestinal barrier and activation of intestinal autophagy

Hongyu Pana,b,c, Qianwang Zhenga,c, Yuan Zoua,c, Guozhao Luoa,c, Mingzhen Tua,c, Na Wangd, Jingru Zhongd, Liqiong Guoa,c,*, Junfang Lina,c,*

a College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510640, China

b Faculty of Food Science and Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China

c Research Center for Micro-Ecological Agent Engineering and Technology of Guangdong Province, Guangzhou 510640, China

d Guangzhou Alchemy Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou 510760, China

*Corresponding author.

Abstract

Ergothioneine is a natural amino acid with powerful antioxidant activity. Previous studies have demonstrated that ergothioneine can increase the lifespan of Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans, and enhance telomerase activity. In present study, the metagenomics sequencing and quantitative real-time polymerase chain reaction analysis were employed to characterize the composition and diversity of gut microbiome in aging flies. And the alterations in the gut barrier, gut morphology, and other gut physiological indicators of aging flies were evaluated. Here, the results showed that ergothioneine induced little variations in gut microbiota composition in flies at mid-life, and significant alterations in the gut microbiota populations were only observed in flies at late -life. And ergothioneine attenuated age-related gut injuries, including decreasing reactive oxygen species levels in intestinal enterocytes, reduction of intestinal cells death, and preservation of gut integrity in aging flies. Ergothioneine also improved the gut morphology by preserving the structure and shape of cell organelles and inducing the intestinal autophagy. And activation of intestinal autophagy also contributed to the longevity effect mediated by ergothioneine in an unidentified mechanism.

Reference:

PAN H Y, ZHENG Q W, ZOU Y, et al. Geroprotection from ergothioneine treatment in

Drosophila melanogaster

翻譯： 李雄（實(shí)習(xí)）

編輯：梁安琪；責(zé)任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲(chóng)創(chuàng)意

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