撰文丨王聰

編輯丨王多魚

排版丨水成文

CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠高效編輯 DNA，它的出現(xiàn)已經(jīng)徹底改變了基因組醫(yī)學(xué)。然而，其對 DNA 的編輯是不可逆的，存在永久性脫靶風(fēng)險，在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。

RNA作為遺傳信息從 DNA 向蛋白質(zhì)的傳遞過程中的橋梁，其源源不斷地從 DNA 轉(zhuǎn)錄而來，因此，對 RNA 進(jìn)行編輯具有瞬時性和可逆性，成為基因編輯療法的一種更安全的替代方案。然而，當(dāng)前主流的 RNA 編輯工具——CRISPR-Cas13，存在著一種重要缺陷——“旁系切割”：在識別目標(biāo) RNA 時也可能會無差別切割細(xì)胞內(nèi)的其他RNA，可能引發(fā)嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，這一問題長期阻礙了其臨床應(yīng)用。

2025 年 8 月 18 日，耶魯大學(xué)可愛龍團(tuán)隊在國際頂尖學(xué)術(shù)期刊Cell上發(fā)表了題為：Conversion of IscB and Cas9 into RNA-guided RNA-editors 的研究論文。

該研究對 Cas9 的祖先IscB以及Cas9自身進(jìn)行了工程化改造，刪除了其 TID/PID 結(jié)構(gòu)域，將它們從原本的 RNA 引導(dǎo)的 DNA 編輯器轉(zhuǎn)換為RNA 引導(dǎo)的 RNA 編輯器，并展示其在可變剪切干擾、反式剪接及 RNA 堿基編輯中的應(yīng)用潛力，其性能可媲美甚至超越了Cas13，且更具安全性，為 RNA 療法、基因調(diào)控及基礎(chǔ)研究提供了全新選擇。

如何將 DNA 剪刀變成 RNA 手術(shù)刀？

作為 II 型 CRISPR-Cas 系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白，Cas9利用相關(guān)的 crRNA/tracrRNA 作為向?qū)В谄ヅ涞哪繕?biāo) DNA 處打開 R-loop，并通過其 HNH 和 RuvC 核酸酶結(jié)構(gòu)域引入 DNA 雙鏈斷裂（DSB） ，進(jìn)而產(chǎn)生 DNA 編輯效果。

2021 年，張鋒團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)了Cas9 的祖先——IscB，這是一種來自 IS200/605 轉(zhuǎn)座子家族的 RNA 引導(dǎo)的歸巢核酸內(nèi)切酶。IscB 蛋白的大小是典型的 Cas9 蛋白的三分之一到一半，缺少 Cas9 中的 REC 結(jié)構(gòu)域，它采用了與 Cas9 類似的整體架構(gòu)，通過相同的機(jī)制在 DNA 目標(biāo)處進(jìn)行搜索和切割。IscB 尺寸小且具有可調(diào)的 DNA 切割活性，這使其成為 CRISPR 2.0 型基因組編輯應(yīng)用的理想平臺，例如堿基編輯和先導(dǎo)編輯。雖然天然存在的 IscB 在人類細(xì)胞中的編輯效率較低，但已有多項研究表明，經(jīng)過工程化改造的 IscB 能夠?qū)崿F(xiàn)更高的插入或刪除以及堿基編輯效率。

實際上，作為 Cas9 的祖先，IscB 天然具備識別并結(jié)合單鏈DNA/RNA 的能力，但其在細(xì)胞內(nèi)更傾向于識別和切割雙鏈 DNA。在這項最新研究中，研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵奧秘——IscB 對 DNA 的識別依賴于TID 結(jié)構(gòu)域（Target-Adjacent Motif Interaction Domain），使其在細(xì)胞內(nèi)傾向于與雙鏈 DNA 結(jié)合，忽略了 RNA。

基于這一發(fā)現(xiàn)，研究團(tuán)隊對 IscB 進(jìn)行了工程化改造，開發(fā)出了刪除 TID 結(jié)構(gòu)域的 IscB——R-IscB（RNA-targeting IscB），其徹底失去了對雙鏈 DNA 的結(jié)合和切割能力，而保留了識別單鏈 DNA/RNA 的能力，其對單鏈 RNA 具有極強(qiáng)的親和力，遠(yuǎn)超 Cas13。

四大應(yīng)用場景：從調(diào)控到修復(fù)全面覆蓋

接下來，研究團(tuán)隊驗證了 R-IscB 作為 RNA 引導(dǎo)的 RNA 編輯器的實際效果——

1、RNA 剪接調(diào)控，例如，靶向杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）致病基因的異常剪接位點，成功實現(xiàn)了突變外顯子跳躍，單次編輯使致病 mRNA 水平下降為之前的 1/8，效果媲美已上市的反義寡核苷酸（ASO）藥物，且無高劑量脫靶風(fēng)險。

2、反式剪接，R-IscB 還能夠在細(xì)胞中實現(xiàn)有效的反式剪接，將正確的 mRNA 外顯子片段引入突變 mRNA 的剪接位點，實現(xiàn)包括點突變、多點突變、外顯子插入/缺失等多種錯誤的修復(fù)，有望用于簡化囊性纖維化等復(fù)雜突變類型遺傳病的治療。

3、RNA 堿基編輯，將 R-IscB 與腺苷脫氨酶 ADAR2 融合， 實現(xiàn)了 A-to-I 的 RNA單堿基精確替換，可用于在 mRNA 水平修復(fù)致病點突變。

4、RNA 切割降解，通過對 R-IscB 的 HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行工程化改造，進(jìn)一步提高了其對單鏈 RNA 的切割活性，在細(xì)胞中顯著降低目標(biāo) mRNA 的水平。

顛覆性優(yōu)勢：超越 Cas13

相比當(dāng)前主流的 RNA 編輯工具——Cas13，R-IscB 具有多種顛覆性優(yōu)勢——

1、零毒性：細(xì)胞生長實驗證實，R-IscB 處理組細(xì)胞無死亡或形態(tài)異常，而 Cas13 處理組細(xì)胞在 24 小時內(nèi)大量凋亡；

2、超高活性：在剪接調(diào)控、RNA 切割等場景中，效率碾壓 Cas13；

3、小型化：R-IscB 的尺寸僅有 Cas13 的一半，更易裝載于 AAV 病毒載體，適合進(jìn)行體內(nèi)遞送，用于體內(nèi) RNA 編輯；

4、技術(shù)普適性：研究團(tuán)隊使用相同策略成功改造 4 種 Cas9 變體——NmeCas9、SaCas9、CjCas9、Cas9d，均使其獲得了高效的 RNA 編輯能力。

該研究的亮點：

• 刪除或破壞 TID 結(jié)構(gòu)域會將 IscB 轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N RNA 編輯酶——R-IscB；

• R-IscB 的活性與 Cas13 相當(dāng)，但沒有明顯的細(xì)胞毒性；

• R-IscB 具有穩(wěn)健的剪接干擾、A to I 編輯和反式剪接能力；

• 同樣的方法將幾種 Cas9 轉(zhuǎn)變?yōu)楦咝У?RNA 編輯器。

總的來說，該研究通過“做減法”，刪除了 IscB 或 Cas9 中的 TID/PID 結(jié)構(gòu)域，讓它們從“基因剪刀”轉(zhuǎn)變?yōu)椤癛NA手術(shù)刀”，這項研究突破了 RNA 編輯的技術(shù)瓶頸，帶來了高效且更具安全性的 RNA 編輯新工具，為 RNA 療法、基因調(diào)控及基礎(chǔ)研究提供了全新選擇。

論文鏈接：

https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(25)00854-2