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Introduction

亞麻是我國西北地區(qū)重要的經濟農作物，屬寧夏特色經濟作物之一，富含多種生物活性物質，具有多種保健功能。亞麻籽油中富含α-亞麻酸、多種酚類、維生素等脂質伴隨物，都是食品中抗氧化劑的良好來源，現(xiàn)已被引入歐洲藥典第9版。目前，關于亞麻籽油的提取工藝主要包括冷榨、熱榨和溶劑浸提等。冷榨工藝能最大限度地降低亞麻籽油脂質氧化，保留活性脂質伴隨物，便于人體吸收相應缺乏的營養(yǎng)物質。機體內氧化平衡紊亂，氧化中間產物大量生成使得自由基過量積累特別是ROS自由基的產生，造成的氧化應激現(xiàn)象被認為是導致機體衰老和疾病的重要因素。H2O2是細胞內ROS的主要貢獻者，已被廣泛用于構建細胞氧化應激模型，以探究各種物質對細胞氧化損傷的影響。

轉錄組測序是利用深度測序技術對全轉錄組進行轉錄分析的方法，為作用機制方面的研究提供有效手段。因此利用轉錄組測序（RNA-seq）技術，篩選和確證抗氧化鈦作用的靶基因，對于明確功能因子的作用機理和抗氧化應激反應中設計的信號轉導機制是非常必要和有效的手段。前期研究表明亞麻籽油具有體外抗氧化活性，然而其生物活性是否促進抗氧化防御酶以及抗氧化基因的表達并維持細胞內抗氧化作用的機制尚不明確。這些問題的闡明對系統(tǒng)深入了解亞麻籽油是否具有抗氧化作用具有關鍵意義。因此本研究擬以“寧亞21號”亞麻籽為研究對象，采用冷榨工藝得亞麻籽油結合細胞實驗，探究冷榨亞麻籽油對HepG2細胞氧化應激的影響，并借助轉錄組測序技術對冷榨亞麻籽油改善HepG2細胞氧化應激的作用機制進行探究，此研究具有應用價值和現(xiàn)實意義，為寧夏亞麻籽油的綜合利用提供相關科學依據(jù)。

Results and Discussion

亞麻籽油中生育酚含量及脂肪酸組成

如表1所示，亞麻籽油中的生育酚主要為γ-生育酚，冷榨亞麻籽油中總生育酚含量為（363.06±26.96）mg/kg。亞麻籽油中，α-亞麻酸含量最高，其次是油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸，冷榨亞麻籽油中α-亞麻酸的含量為54.49%（表2）。

表1冷壓亞麻籽油中生育酚的組成（mg/kg）

表2冷壓亞麻籽油主要脂肪酸組成（%）

冷壓亞麻籽油對過氧化氫誘導的HepG2細胞存活率的影響

如圖1所示，模型組的細胞存活率較低（63.58%），隨著冷榨亞麻籽油中脂肪酸濃度的增加，細胞存活率逐漸提高。當脂肪酸濃度為0.3 mmol/L時，細胞存活率達到83.75%，預保護效果最佳。這可能是因為亞麻籽油中的多不飽和脂肪酸含有更多的不飽和雙鍵能夠有效清除H2O2產生的自由基，且亞麻籽油覆蓋在細胞膜表面，降低了膜的極性，從而防止自由基損傷。

圖1冷壓亞麻籽油對過氧化氫誘導的HepG2細胞存活率的影響

冷壓亞麻籽油對過氧化氫誘導的HepG2細胞內ROS水平的影響

細胞內活性氧主要是一系列由線粒體氧化呼吸電子傳遞鏈在有氧呼吸過程中產生的活性氧簇，如O2?、H2O2和?OH。這些活性氧主要通過氧化磷酸化和有氧代謝的酶促反應產生。當細胞受損時，線粒體功能下降，膜結構完整性破壞，線粒體可以產生更多的活性氧，過量的活性氧可能導致炎癥因子過度表達和分泌，從而引發(fā)體內氧化應激。研究發(fā)現(xiàn)，亞麻籽油可以減少細胞的氧化應激，這與亞麻籽油中的天然抗氧化成分多酚、γ-生育酚和β-胡蘿卜素有關。如圖2所示，與空白組相比，模型組的ROS含量顯著升高（P＜0.05），而處理組的ROS水平逐漸降低，并具有顯著性（P＜0.05）。高劑量組的ROS水平最低，這可能與冷榨亞麻籽油中的酚類、黃酮類和脂質伴隨物有關。

圖2冷壓亞麻籽油對H2O2誘導的HepG2細胞內ROS水平的影響

冷壓亞麻籽油對過氧化氫誘導的HepG2細胞MDA水平的影響

人體存在一個天然的氧化調節(jié)系統(tǒng)，能夠一定程度上抵抗外部氧化應激，防止身體損傷。當氧化程度過高時，細胞膜可能會產生MDA，最終導致細胞壞死和凋亡。如圖3所示，模型組細胞內MDA顯著高于空白組（P＜0.05），且隨著冷榨亞麻籽油中脂肪酸濃度的增MDA含量逐漸降低，呈劑量依賴性關系，中高劑量組的MDA濃度顯著降低（P＜0.05）。結果表明，H2O2對HepG2細胞的細胞膜造成了嚴重損害，而提前加入一定量的冷榨亞麻籽油后顯著緩和過氧化氫對細胞膜脂質氧化損傷的程度，緩解了自由基的氧化損傷，這可能與亞麻籽油中的脂質具有一定的抗氧化活性有關。

圖3冷壓亞麻籽油對H2O2誘導的HepG2細胞MDA水平的影響

冷壓亞麻籽油對過氧化氫誘導的HepG2細胞谷胱甘肽含量的影響

如圖4所示，與空白組相比，模型組的GSH/GSSG值顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組的GSH/GSSG值隨著亞麻籽油脂肪酸濃度的增加而逐漸增加，表明添加亞麻籽油在一定程度上減輕了細胞的氧化應激。

圖4冷壓亞麻籽油對H2O2誘導的HepG2細胞中谷胱甘肽含量的影響

冷壓亞麻籽油對過氧化氫誘導的HepG2細胞抗氧化酶活性的影響

如圖5所示，與空白組相比，模型組中SOD、CAT和GSH-Px的活性顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，隨著冷榨亞麻籽油中脂肪酸濃度的增加，各處理組的抗氧化酶水平顯著升高，表明冷榨亞麻籽油在一定程度上緩解了細胞的氧化應激。因此，可表明加入1.4 mmol/L的H2O2能一定程度破壞細胞的氧化調節(jié)系統(tǒng)，使細胞的氧化酶系的水平降低，導致細胞內的氧化動態(tài)平衡異常，最終促使細胞因氧化產生不可逆的損傷，同時也驗證說明采用1.4 mmol/L的H2O2成功構建氧化應激模型，加入亞麻籽油提前預保護培養(yǎng)后能緩解H2O2對細胞造成氧化損傷致使細胞內的抗氧化物酶系水平降低，對HepG2細胞氧化損傷具有有保護作用，能提高機體對抗外界造成的氧化應激的調控能力，這與郭增旺等人研究結果相似。這也與細胞存活率和ROS水平的結果一致。

圖5冷壓亞麻籽油對H2O2誘導的HepG2細胞內抗氧化酶活性的影響

測序結果質量評價

為了研究冷壓亞麻籽油對HepG2細胞氧化應激損傷的保護機制，建立了5組處理細胞的cDNA文庫，并為每種處理設置了3組生物學重復。測序后，對數(shù)據(jù)質量進行了綜合評估（表3）。Q20和Q30分別指測序質量超過99.0%和99.9%的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的比例，通常Q20＞85%，Q30＞80%，所有樣本的Q20值均超過97%，Q30均高于92%，表明測序結果可靠，可用于后續(xù)分析。此外，全基因組的GC含量在51%到52%之間，說明轉錄組測序過程中覆蓋的整個區(qū)域沒有偏差，確保了后續(xù)剪接和注釋的可靠性。

表3基礎信息統(tǒng)計

堿基分布用于檢測堿基分離的存在，而這種現(xiàn)象可能是測序或者建庫所帶來的，并且會影響后續(xù)的定量分析。理論上，在每個測序周期中G與C、A與T的含量應該是相等的，整個測序過程應該是穩(wěn)定呈水平線。如圖6所示，每個位置的堿基數(shù)含量都具有較好的穩(wěn)定性。堿基組成的曲線與AT和GC重合，沒有分離，表明所有細胞樣本都具有高質量的堿基測序。

圖6轉錄組清潔讀段的堿基含量分布

利用DESeq2分析軟件，對五組處理進行基因表達量差異分析，以鑒定出差異表達的基因。兩組樣本間基因表達量差異的倍數(shù)變化值以FC表示，基因表達量變化差異的統(tǒng)計學檢驗值為P值。根據(jù)基因表達量（TPM值）計算，P≤0.05且|log2 FC|≥2的基因被視為顯著性差異表達基因。圖7顯示了不同處理組中差異表達基因的火山圖，空白組與模型組之間有1074個差異基因，其中643個基因上調，431個基因下調；高劑量組與模型組之間有115個差異基因，其中37個基因上調，78個基因下調。對空白組與模型組以及模型組與高劑量組之間的差異基因進行了進一步的富集分析，共鑒定出32個差異基因。

圖7差異表達基因（DEGs）的火山圖和維恩圖

差異基因GO分類包括生物過程（Biological process）、細胞組分（Cellular component）和分子功能（Molecular function）3大功能類。以富集程度前20的通路為主，對差異基因進行GO與KEGG富集分析，如圖7所示。差異基因主要涉及生物學功能（biological process）中的細胞過程（cellular process）、生物調節(jié)（biological regulation）、代謝過程（metabolic process）；分子功能中的細胞外部分、膜部分、細胞器部分；細胞成分中的結合、催化活性、轉運蛋白活性。對差異基因進行KEGG富集分析探究冷榨亞麻籽油對HepG2細胞氧化應激保護相關作用通路，發(fā)現(xiàn)篩選的DEGs主要涉及的通路包括mTOR信號通路、MAPK信號通路。

圖8 GO和KEGG差異表達基因的富集分析

Conclusion

實驗以“寧亞21號”冷榨亞麻籽油為研究對象，選用H2O2構建HepG2細胞氧化應激損傷模型，分別從細胞存活率、胞內ROS水平、MDA水平、抗氧化酶系活力和轉錄組學探討冷榨亞麻籽油對氧化應激損傷的保護作用。結果表明：冷榨亞麻籽油能顯著降低H2O2引起的HepG2細胞存活率的降低和胞內ROS、MDA水平的升高，恢復抗氧化酶系酶活力。通過轉錄組學分析得出冷榨亞麻籽油能夠有效保護HepG2細胞緩解其氧化應激程度，其機制可能是通過調節(jié)mTOR信號通路和MAPK信號通路相關基因的表達對HepG2細胞氧化損傷起保護作用。

01

第一作者

馬麗芳，女，寧夏大學食品科學與工程學院食品加工與安全專業(yè)在讀研究生。

02

通信作者

傅婧，女，博士，碩士導師，寧夏大學食品科學與工程學院講師，第五批自治區(qū)青年科技人才托舉工程人選，主要從事糧油食品營養(yǎng)與安全方面的教學科研工作。參與寧夏回族自治區(qū)科學技術廳，自治區(qū)重點研發(fā)計劃項目子課題，枸杞葉“新食品原料”研究與開發(fā)；寧夏自然科學基金委員會，寧夏自然科學基金項目，亞麻籽成熟過程中油脂累積及脂肪酸組分變化的分子生理機制；寧夏回族自治區(qū)科學技術廳，自治區(qū)重點研發(fā)計劃項目，寧夏小雜糧精深加工與營養(yǎng)調控關鍵技術和產業(yè)示范；寧夏自然科學基金委員會，寧夏自然科學基金項目，亞麻籽油基于細胞模型調控氧化應激及其機理研究；2020年自治區(qū)人才項目，2020年度自治區(qū)青年科技人才托舉工程等。

Cold-pressed flaxseed oil alleviates H2O2-induced oxidative stress in HepG2 cells by regulating the expression of the genes related to mTOR and MAPK signaling pathway

Lifang Ma, Fan Zao, Jing Fu*

College of Food Science and Engineering, Ningxia University, Yinchuan, 750021, China

*Corresponding author.

Abstract

Objective

To investigate the protective effect of cold-pressed flaxseed oil on oxidative damage in HepG2 cells and its mechanism.

Methods

HepG2 cells were cultured and divided into blank group, model group and cold-pressed flaxseed oil groups (low, medium and high dose). The effects of cold-pressed flaxseed oil on cell survival rate, levels of reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA), and activities of antioxidant enzymes in the H2O2-induced oxidative stress injury model were determined.

Results

The results showed that cold-pressed flaxseed oil significantly alleviated the cell growth inhibition induced by H2O2, significantly decreased the levels of intracellular ROS and MDA, and increased the activities of superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase (P?<?0.05). Transcriptomic analysis identified 32 differentially expressed genes (DEGs). GO analysis found that these DEGs were mainly involved in cellular processes, biological regulation, metabolic processes and transporter activities. The results of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analysis showed that the DEGs were mainly involved in mammalian target of rapamycin, mTOR signaling pathway and MAPK signaling pathway.

Conclusion

Cold-pressed flaxseed oil effectively protected HepG2 cells from oxidative damage, possibly by regulating the expression of the genes related to mTOR signaling pathway and MAPK signaling pathway.

Reference:

Ma, L., Zao, F. & Fu, J. Cold-pressed flaxseed oil alleviates H2O2-induced oxidative stress in HepG2 cells by regulating the expression of the genes related to mTOR and MAPK signaling pathway. Agric. Prod. Process. Sto. 1, 9 (2025). https://doi.org/10.1007/s44462-025-00012-w

本文編譯內容由作者提供

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片來源：圖蟲創(chuàng)意

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