蝦肝腸胞蟲 （EHP） 是肝胰小孢子 （HPM） 的病原體，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖對蝦，尤其是南美白對蝦。雖然在白對蝦養(yǎng)殖中，EHP的爆發(fā)趨勢有越來越明顯，但目前EHP對斑節(jié)對蝦的致病性數(shù)據(jù)有限。因此，本研究旨在通過EHP感染檢測比較兩種蝦的易感性。

在實(shí)驗(yàn)之前，檢查實(shí)驗(yàn)蝦是否沒有被EHP和WSSV感染，保證選擇健康的個體。斑節(jié)對蝦（2±0. 1g）和南美白對蝦（2±0.05g），各20尾。實(shí)驗(yàn)在100 LFRP罐中持續(xù)實(shí)驗(yàn)90天，使用過濾海水，pH8±0.3，溫度28°C，鹽度28 ppt。根據(jù)Kuma 等人 （2022b） 對蝦進(jìn)行口服感染：感染組飼喂受EHP感染的肝胰混合飼料（1：1比例）4天，每天2次，相當(dāng)于體重的5%；對照組使用商業(yè)飼料。前7天收集糞便并儲存在4°C下。 在感染后15、30、60和90天采集肝胰標(biāo)本 （n = 3） 進(jìn)行顯微鏡檢查、ISH和qPCR分析，并且，每周監(jiān)測生存率和生長速度。

一、通過光學(xué)和組織學(xué)顯微鏡觀察：

對蝦進(jìn)行無菌解剖，取新鮮的肝胰腺和糞便纖維作為鈣熒光白色染色標(biāo)本（CFW：KOH，1：1），并在熒光顯微鏡（EVOS，Thermo Fisher）下觀察。將肝胰腺組織樣本固定在戴維森AFA溶液中，經(jīng)Bell & Lightner （1988） 處理，切片 （4um），用H&E染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察（Nikon Eclipse E200）。

圖1：感染后15天（A1）、感染后30天（A2）、感染后60天（A3）、感染后90天（A4）感染EHP的斑節(jié)對蝦肝胰腺（HP）的組織學(xué)切片和感染后15天（B1）、感染后30天（B2）、感染后60天（B3）、感染后90天（B4）感染EHP的白對蝦的組織學(xué)切片。A2和A3顯示HP小管壞死（圓形，x 100）。A4顯示HP小管上皮變?。ㄖ奔^，x100）。B1，B2，B3，B4顯示HP小管嚴(yán)重壞死（圓形，X 100）。 B1顯示上皮細(xì)胞脫離（箭頭，x 100），B4顯示血細(xì)胞感染（箭頭，x 100）。B2、B3顯示HP導(dǎo)管從基底膜變性和脫離（箭頭，x 100）。

1、DNA提取、PCR和qPCR：

通過CTAB法提取肝胰腺和糞便纖維中的DNA，用納米光度計(jì)定量并儲存在20°C。PCR使用SWP孢子基因特異性引物（Jaroenlak等人，2016）。在1.5%瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物。使用Kumar等人（2022a）的方法進(jìn)行qPCR，使用StepOne（Applied Biosystems）系統(tǒng)和稀釋質(zhì)粒DNA的參考系。

2、原位雜交 （ISH）：

ISH跟隨Rajendran等人（2016）使用DIG標(biāo)記的SWP-PCR探針。對組織進(jìn)行處理、去對羥基纖維化、消化蛋白酶K，然后在42°C下與探針雜交混合。結(jié)果用堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗DIG抗體和BCIP/NBT底物呈現(xiàn)，然后用俾斯麥布朗Y進(jìn)行背景染色。

3、跟蹤增長和生存率：

每天監(jiān)測生存率，每周測量體重。生長指標(biāo)包括：平均體重（ABW）、平均日生長（ADG）、體重增加、比生長率（SGR）、肝臟指數(shù)（HSI）和生存率。

圖2：感染后90天受EHP攻擊的蝦肝胰腺 （HP） 的組織學(xué)切片（A1-斑節(jié)對蝦；A2-白對蝦）。A1顯示EHP的發(fā)育階段（直箭頭，x 1000）。A2顯示發(fā)育的第二階段（直箭頭，x 1000）、顆粒狀（星形，x 1,000）、嚴(yán)重壞死（圓形 x 1,000）和孢子狀結(jié)構(gòu)（方形，x 1,000）。

二、結(jié)果：

1、組織學(xué)觀察結(jié)果：

用植物細(xì)胞壁鈣熒光白(（CFW）染色的EHP感染蝦的肝胰腺在不同樣本采集時間顯示孢子的存在。在斑節(jié)對蝦蝦中，肝胰組織學(xué)記錄到30和60 dpc時有輕度病變，伴有導(dǎo)管壞死[圖1A2、A3]，在90 dpc時有病變（圖2A1）和腎小管上皮退化（圖1A4）。

相比之下，南美白對蝦在整個實(shí)驗(yàn)過程中表現(xiàn)出更嚴(yán)重的病變，包括變性、導(dǎo)管壞死、上皮脫離和血細(xì)胞感染（圖1B1-B4）。還觀察到EHP發(fā)育的多個階段，例如：前期感染階段、顆粒和孢子階段（圖2A2）。

這兩個物種的新鮮肝胰腺標(biāo)本都表現(xiàn)出特征性的聚集的轉(zhuǎn)化微絨毛（ATM）樣結(jié)構(gòu)[圖2B1、B2]。ISH在90 dpc時在白對蝦中顯示出明顯的陽性信號，而斑節(jié)對蝦沒有可檢測到的信號（圖2C1、C2）。CFW染色還顯示白對蝦的孢子密度明顯高于斑節(jié)對蝦（圖3A、B）。

圖3：植物細(xì)胞壁鈣熒光白染色顯示，與上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中大量孢子（紅星，x 1,000）和EHP感染的HP組織。

2、PCR和qPCR結(jié)果：

感染EHP的南美白對蝦，在采用PCR檢測，7天后顯示出EHP陽性結(jié)果，而斑節(jié)對蝦（P. monodon）發(fā)現(xiàn)呈陽性較晚。該結(jié)果在整個實(shí)驗(yàn)期間保持在90 dpc（圖4），對照組的EHP始終呈陰性。

qPCR分析顯示，斑節(jié)對蝦的EHP載量隨時間增加，范圍為5.6–10.3x103拷貝/uL的DNA，峰值為60dpc（9.0–12.6x103），其次是90dpc（7.5–10.8x103）、15dpc（5.8–7.0x103）和30 dpc（4.8–6.4x103）。同時，南美白對蝦中的EHP載量明顯更高，從1.5–5.3x105拷貝/uL的DNA。 最高水平記錄在90 dpc （4.0–6.3x105） 時，其次是60dpc（2.0–3.4x105）、15dpc（1.0–2.4x105） 和30dpc（1.0–2.2x105）。結(jié)果表明，南美白對蝦明顯高于斑節(jié)對蝦的EHP負(fù)荷（圖5）。

圖4：SWP-PCR從15（A）、30（B）、60（C）和90（天）感染EHP的斑節(jié)對蝦（M1、M2、M3）和南美白對蝦（V1、V2）的肝胰腺DNA。

圖5：實(shí)驗(yàn)感染的斑節(jié)對蝦和南美白對蝦在15、30、60和90 dpc的不同時間間隔的EHP負(fù)荷。

圖6：在試驗(yàn)期間（感染后90天），斑節(jié)對蝦和南美白對蝦感染EHP和對照組（未感染）的生長性能。

3、實(shí)驗(yàn)蝦的生長和成活率：

感染后90d（dpc）EHP感染斑節(jié)對蝦（4.48±0.16g）和EHP感染白對蝦（7.05±0.07g）均較對照組（5.23±0.14g）和（9.22±0.16g）明顯下降。斑節(jié)對蝦和白對蝦的體重增加（AW）分別為2.47±0.21 g和5.01±0.12 g，低于對照組（3.23±0.19g）和7.26±0.22g。

感染的斑節(jié)對蝦比生長速率（SGR）（0.89±0.07%/d）低于對照組（1.07 ± 0.06%/d），但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。同時，感染白對蝦的SGR（1.37 ± 0.79%/d）明顯低于對照組（1.72±0.05%/d）。

感染斑節(jié)對蝦和白對蝦的平均日生長率（ADG）分別為27.4±2.3 mg和55.6 ± 1.4 mg，明顯低于對照組（35.9±2.1mg和80.6±2.5mg）。EHP感染后，兩種蝦的肝體指數(shù)（HSI）也呈下降趨勢：斑節(jié)對蝦（4.60 ± 0.85%）與對照組（4.74±0.38%）相比，白對蝦（5.32±0.55%）與對照組（5.90±0.12%）相比。

受感染斑節(jié)對蝦的存活率（75±12.50%）明顯低于對照組（79.16±14.43%）。然而，與對照組（62.5±0%）相比，受感染白對蝦的存活率急劇下降（37.5±17.60%），盡管這種差異也沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的水平，各組之間的大小差異如圖7所示。

圖7：（A1）對照組（未感染）和（A2）被EHP感染的斑節(jié)對蝦與（B1）對照組（未感染）白對蝦和（B2）被EHP感染的白對蝦在90 dpc下的生長速度和大小比較。

三、結(jié)論：

本研究是斑節(jié)對蝦感染EHP的首次報告。結(jié)果表明，盡管斑節(jié)對蝦蝦有可能感染EHP，但在載量、組織學(xué)病變和原位雜交信號方面的影響水平顯著低于白對蝦。因此。使用無病原體的斑節(jié)對蝦（SPF）蝦苗后，以及嚴(yán)格的管理措施可能是將EHP對水產(chǎn)養(yǎng)殖的影響降至最低的可行策略。然而，需要進(jìn)一步的研究來闡明兩個物種之間易感性和病理表達(dá)差異的潛在生物學(xué)機(jī)制。