中文摘要

目的探討平行性檢驗在未涉及生理活性生物體的ELISA四參數(shù)模型和平行線模型數(shù)據(jù)分析中的應(yīng)用。

方法在未進行平行性檢驗的2種ELISA，腸道病毒71型體外相對效力插值法檢測的四參數(shù)模型和腸道病毒71型抗原含量檢測的平行線模型中，選取不同水平供試品檢測數(shù)據(jù)，對不進行平行性檢驗獲得的結(jié)果、平行性檢驗后偏離平行不顯著的結(jié)果、平行性檢驗后偏離平行顯著的結(jié)果進行一致性比較。

結(jié)果不同的數(shù)據(jù)分析模式均未導(dǎo)致結(jié)果波動，變異系數(shù)為2.9%~17.9%；將四參數(shù)模型插值法與偏離平行不顯著結(jié)果、插值法與偏離平行顯著結(jié)果進行配對t檢驗分析，除插值法與偏離平行顯著結(jié)果對比中2.0水平P<0.001（t=0.11）外，其他組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；將平行線模型原始計算方法結(jié)果分別與偏離平行不顯著結(jié)果和偏離平行顯著結(jié)果進行配對t檢驗分析，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)論無論平行性檢驗偏離平行顯著與否，其計算結(jié)果均與原始計算結(jié)果一致，經(jīng)過數(shù)據(jù)分析模型篩選、進行過完整的方法學(xué)驗證的ELISA，能夠選擇性使用平行性檢驗。

正文

在生物制品檢測方法建立之初，首先要明確區(qū)分利用具有生理活性的生物體進行的生物活性/效價測定法和未涉及生理活性生物體的ELISA檢測法。利用有生理活性生物體的方法收錄于中國藥典2020年版三部（藥典三部）生物檢定生物活性/效價測定法，收錄的35種方法中有7種嚴(yán)格進行平行性檢驗。未涉及生理活性生物體的ELISA收錄于藥典三部生物測定法，收錄的29種方法除鑒別實驗或定性實驗的11種方法外，均為插值法。藥典三部通則3429指出，ELISA的數(shù)據(jù)定量分析方式通常是將供試品結(jié)果代入已知濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算而得，可采用簡單的線性模型或復(fù)雜的非線性模型。

涉及生理活性生物體的檢測方法由于方法本身變異度大、生物體不可控，需同時測定供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的劑量反應(yīng)曲線，且2條曲線需平行，即供試品與標(biāo)準(zhǔn)品僅有量的不同而沒有質(zhì)的區(qū)別才能準(zhǔn)確計算相對活性，是不同計算方法結(jié)果達(dá)到統(tǒng)一的前提。在國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會 M10、藥典三部通則1431 生物檢定統(tǒng)計法、美國藥典（USP44）General Chaper 1034 Analysis of Biological Assay中，實驗可靠性的測驗標(biāo)準(zhǔn)之一即為平行性檢驗符合要求。未涉及生理活性生物體的ELISA常見數(shù)據(jù)分析是通過在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的插值確定待測物濃度，或比較標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測物的響應(yīng)曲線以檢測待測物相對于標(biāo)準(zhǔn)品的相對效力。近幾年我國部分ELISA在方法開發(fā)和驗證階段參考藥典三部通則9401 生物制品生物活性/效價測定方法驗證指導(dǎo)原則和1431生物檢定統(tǒng)計法完成，根據(jù)生物檢定統(tǒng)計法要求進行實驗可靠性評估，其中1項為平行性檢驗。本研究擬通過插值法確定待測物濃度的四參數(shù)模型（以下簡稱為四參數(shù)）擬合數(shù)據(jù)、未進行平行性檢驗的平行線模型數(shù)據(jù)（以下簡稱為平行線模型），以2組數(shù)據(jù)分析平行性檢驗在未涉及生理活性生物體的ELISA中的應(yīng)用。

1

材料與方法

1.1

主要材料和儀器

腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）抗原含量檢測標(biāo)準(zhǔn)品（批號202002）購自中國食品藥品檢定研究院；EV71原液由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生物制品八室提供；EV71半成品為自配樣品；EV71抗原含量檢測試劑由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生物制品九室提供；EV71體外相對檢測試劑為自建體系；多功能酶標(biāo)儀BioTek epoch2購自美國BioTek公司，配套分析軟件為Gen5；四參數(shù)模型平行性檢驗軟件為JMP軟件；平行線模型平行線檢驗軟件為中國食品藥品檢定研究院研發(fā)的Statistical Analysis。

1.2

數(shù)據(jù)

插值法確定待測物濃度的四參數(shù)模型數(shù)據(jù)為EV71體外相對效力檢測方法驗證數(shù)據(jù)，0.5、0.7、1.0、2.0驗證水平即為檢測范圍。平行線模型數(shù)據(jù)為EV71抗原含量檢測數(shù)據(jù)，水平1、水平2分別為低、高檢測值。

1.3

不進行平行性檢驗的數(shù)據(jù)分析

1.3.1　四參數(shù)模型EV71體外相對效力檢測方法為四參數(shù)模型數(shù)據(jù)分析，采用插值法計算供試品相對效力。標(biāo)準(zhǔn)品與供試品均2倍線性稀釋7~8孔，雙復(fù)孔上樣取均值計算，在Gen5軟件中以標(biāo)準(zhǔn)品效價理論值（橫坐標(biāo)）與其對應(yīng)的檢測吸光度值（縱坐標(biāo)）進行l(wèi)ogistic Rodbard四參數(shù)曲線擬合。將供試品各個稀釋度檢測吸光度值代入公式計算相對效價，最終選取供試品對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值范圍內(nèi)各稀釋度相對效價均值作為最終效價。

四參數(shù)模型方程：Y=（A-D）/［1+（X/C）B］+D。該方程為S型曲線，參數(shù)A為曲線上漸近線，D為下漸近線，C為半數(shù)反應(yīng)處的濃度或效價，B為斜率。

1.3.2　平行線模型EV71抗原含量檢測方法采用平行線模型計算供試品抗原含量，標(biāo)準(zhǔn)品和供試品均為直線線性擬合。標(biāo)準(zhǔn)品與供試品均2倍線性稀釋7~8孔，雙復(fù)孔上樣取均值，分別選擇cutoff值以上5個稀釋度吸光度值代入公式計算抗原含量。數(shù)據(jù)分析方式同藥典三部3502甲型肝炎疫苗體外相對效力檢查法（等反應(yīng)劑量比值）。

1.4

進行平行性檢驗的數(shù)據(jù)分析

1.4.1　四參數(shù)模型采用JMP軟件對標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的量效曲線分別進行平行性檢驗，程序為：采用約束模型，即模型中除C值外共享所有參數(shù)，以F-prob作為判斷2條曲線是否平行的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)F-prob≥0.05時，判定2條曲線平行，反之判為不平行。在進行平行性檢驗過程中可刪除標(biāo)準(zhǔn)品或供試品上端或下端點，選取至少5個連續(xù)的點進行曲線擬合并評價平行性。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品量效曲線平行時，二者半數(shù)效應(yīng)濃度（median effect concentration，EC50）非常接近，用等反應(yīng)劑量比值（C值比值）計算樣品相對效價可代表最終結(jié)果。

無論平行與否均按以下公式計算相對效價（斜率比）：

其中EC50即為約束模型下量效曲線中的C值。

1.4.2　平行線模型采用Statistical Analysis中Parallel Line Assay模塊對標(biāo)準(zhǔn)品和供試品量效曲線進行平行性檢驗，根據(jù)F-prob判斷2條曲線是否平行、直線回歸是否有意義，當(dāng)F-prob（直線回歸）、F-prob（平行）均≥0.05時，判定2條直線偏離平行、偏離線性均不顯著。在進行可靠性檢驗時，可刪除標(biāo)準(zhǔn)品或供試品上端或下端點，標(biāo)準(zhǔn)品至少選取4個連續(xù)的點、供試品至少選取3個連續(xù)的點進行線性和平行性檢驗。

無論平行與否均按以下公式計算相對效價：

供試品抗原含量=標(biāo)準(zhǔn)品抗原含量×R

其中R為標(biāo)準(zhǔn)品和供試品等反應(yīng)劑量比值。

1.5

統(tǒng)計分析

采用JMP軟件對不進行平行性檢驗獲得的結(jié)果、偏離平行不顯著結(jié)果、偏離平行顯著結(jié)果進行配對t檢驗，對不同的結(jié)果進行一致性比較。

2

結(jié)果

2.1

四參數(shù)模型結(jié)果

累積30組左右EV71體外相對效力檢測數(shù)據(jù)，對各水平數(shù)據(jù)分別進行插值法計算、偏離平行不顯著數(shù)據(jù)計算、偏離平行顯著數(shù)據(jù)計算。大部分?jǐn)?shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品偏離平行不顯著，結(jié)果見表1，插值法和偏離平行不顯著結(jié)果變異系數(shù)相近。部分?jǐn)?shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品偏離平行顯著，結(jié)果見表2，插值法和偏離平行顯著結(jié)果變異系數(shù)接近。說明不同的數(shù)據(jù)分析模式均未導(dǎo)致結(jié)果波動。

將插值法與偏離平行不顯著結(jié)果、插值法與偏離平行顯著結(jié)果進行配對t檢驗統(tǒng)計分析，除了插值法與偏離平行顯著結(jié)果對比中2.0水平P<0.001，其他組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。分析插值法與偏離平行顯著結(jié)果對比中2.0水平數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，雖然偏離平行顯著組計算結(jié)果明顯低于插值法，但插值法結(jié)果更接近于2.0理論值。

2.2

平行線模型

累積50組左右EV71抗原含量檢測數(shù)據(jù)，分別對不同水平供試品進行原始計算方法、偏離平行不顯著數(shù)據(jù)計算、偏離平行顯著數(shù)據(jù)計算。大部分標(biāo)準(zhǔn)品和供試品偏離平行不顯著，結(jié)果見表4，原始計算結(jié)果和偏離平行不顯著結(jié)果變異系數(shù)相近。部分?jǐn)?shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和供試品偏離平行顯著，結(jié)果見表5，原始計算結(jié)果和偏離平行顯著結(jié)果變異系數(shù)接近。說明不同的數(shù)據(jù)分析模式均未導(dǎo)致結(jié)果波動。

將原始計算結(jié)果與偏離平行不顯著結(jié)果、原始計算結(jié)果與偏離平行顯著結(jié)果進行配對t檢驗統(tǒng)計分析，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，表明無論偏離平行顯著與否結(jié)果均與原始計算結(jié)果一致，見表6。

3

本研究數(shù)據(jù)來源于未涉及生理活性生物體的ELISA的2種數(shù)據(jù)分析模式，分別為插值法的四參數(shù)模型數(shù)據(jù)和不進行平行性檢驗的平行線模型數(shù)據(jù)，分析不進行平行性檢驗的原始計算結(jié)果、進行平行性檢驗的偏離平行不顯著結(jié)果和偏離平行顯著結(jié)果之間的差異，結(jié)果顯示ELISA數(shù)據(jù)進行平行性檢驗偏離平行與否均不影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。有研究也得出相關(guān)結(jié)論，平行性檢驗通過的量反應(yīng)平行線法和插值法無差異。有學(xué)者在ELISA開發(fā)過程、驗證階段評價標(biāo)準(zhǔn)品和供試品數(shù)據(jù)劑量反應(yīng)曲線的平行性，在檢測過程中不進行平行性檢驗，即平行性檢驗并非實驗必要操作。本研究數(shù)據(jù)同樣得出平行性檢驗通過與否和插值法結(jié)果均無差異、平行性檢驗非必要操作的結(jié)論，前提是在ELISA建立過程中經(jīng)過數(shù)據(jù)分析模型篩選，進行過完整的方法學(xué)驗證，確定該檢測方法檢測數(shù)據(jù)穩(wěn)定、準(zhǔn)確。插值法與偏離平行顯著結(jié)果對比中2.0水平P<0.001，由于該水平為檢測范圍上限200%，已遠(yuǎn)超檢測范圍上限，因此結(jié)果有偏離是正常的，且本檢測方法中使用的已驗證的插值法結(jié)果準(zhǔn)確度更高。

在EV71體外相對效力ELISA開發(fā)過程中，使用了BioTek epoch2酶標(biāo)儀自帶軟件Gen5四參數(shù)logistic Rodbard進行模型擬合，采用插值法進行數(shù)據(jù)分析。較寬濃度范圍樣品雖能夠在ELISA中產(chǎn)生直觀的濃度-吸光度值S型曲線，也是四參數(shù)檢測體系的優(yōu)勢，但定量范圍僅限于曲線的陡峭部分，以避免插值誤差。本研究所用的多點插值求均值法與WHO 2013年推薦的肺炎鏈球菌莢膜多糖型特異性IgG抗體定量ELISA標(biāo)準(zhǔn)方法指導(dǎo)文件中采用的計算方法相同，即將連續(xù)稀釋樣品中各稀釋度吸光度值代入四參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算濃度，以最終均值作為樣品濃度值，并對數(shù)據(jù)做了限定：復(fù)孔變異系數(shù)大于15%則排除在外，多次稀釋的濃度數(shù)據(jù)變異系數(shù)超過30%則需要重新測定。這種多點插值求均值計算形式較單點插值法更準(zhǔn)確，因單點插值僅采用1個稀釋度樣品吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度，所以產(chǎn)生偏差的概率較高。研究中四參數(shù)模型2.0水平插值法和偏離平行顯著數(shù)據(jù)結(jié)果也支持此結(jié)論，標(biāo)準(zhǔn)品和供試品量效曲線平行性檢驗通過得出的結(jié)果較多點插值求均值的方法準(zhǔn)確度差，由此可知多點插值求均值更能準(zhǔn)確應(yīng)用于ELISA數(shù)據(jù)分析中，同時平行性檢驗并非必要操作。

平行性檢驗在質(zhì)量控制中發(fā)揮著重要作用，需根據(jù)檢測方法本身的變異范圍、檢測需求對平行性檢驗的使用進行評估，在未涉及生理活性生物體的ELISA中并非必要實驗操作。

作者

劉正玲1 趙勇2 蔣曦2 李婭嫻2 杜宋婷2 楊富茜2 趙紅2 李亞東2

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生物制品九室，昆明 650503；2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所質(zhì)量檢定室，國家藥品監(jiān)督管理局疫苗及生物制品質(zhì)量控制與評價重點實驗室，昆明 650503

劉正玲和趙勇對本文有同等貢獻(xiàn)

通信作者：李亞東，

Email：yadong_li@imbcams.com.cn

引用本文：劉正玲, 趙勇, 蔣曦, 等.平行性檢驗在ELISA四參數(shù)模型和平行線模型數(shù)據(jù)分析中的應(yīng)用[J]. 國際生物制品學(xué)雜志, 2025, 48(4): 247-252.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20241106-00070

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