四、多表位疫苗的設(shè)計(jì)與優(yōu)化

4.1 表位篩選標(biāo)準(zhǔn)與結(jié)果

研究通過(guò)層層篩選，從 PE_PGRS16 中鑒定出符合以下條件的表位：

• 抗原性：VaxiJen 評(píng)分＞0.4（細(xì)菌抗原閾值）；

• 安全性：無(wú)毒性（ToxinPred 預(yù)測(cè)）、無(wú)致敏性（AllerTrop 驗(yàn)證）；

• 免疫活性：能誘導(dǎo) IgG 抗體（IgPred 評(píng)分≥0.9）和 γ 干擾素（IFN-γ，CTL 和 HTL 表位關(guān)鍵功能）。

最終篩選出 4 個(gè) B 細(xì)胞表位、3 個(gè) CTL 表位和 2 個(gè) HTL 表位（表 1、表 2），例如 B 細(xì)胞表位 “GGLGGSGGTGGAGMAA” 的 IgG 評(píng)分達(dá) 0.956，CTL 表位 “GLTYNYNTY” 的抗原性評(píng)分 0.952，均滿足設(shè)計(jì)要求。

4.2 疫苗構(gòu)建與佐劑選擇

疫苗構(gòu)建采用模塊化設(shè)計(jì)：

• 表位連接：B 細(xì)胞與 HTL 表位用 GPGPG linker 連接（維持柔性），CTL 表位用 AAY linker 連接（增強(qiáng) MHC I 類分子呈遞）；

• 佐劑整合：加入Griselymycin（序列 VPSLPLVPLG）作為佐劑，通過(guò) EAAAK linker 連接于 N 端和 C 端，其可激活 TLR 通路增強(qiáng)免疫應(yīng)答；

• 理化性質(zhì)優(yōu)化：最終疫苗含 185 個(gè)氨基酸，分子量 16.3 kDa，等電點(diǎn) 4.43，不穩(wěn)定指數(shù) - 31.31（＜40，屬穩(wěn)定蛋白），溶解度 0.651（高于大腸桿菌蛋白平均值 0.45）。

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，疫苗包含 α- 螺旋（粉色）、β- 折疊（黃色）和無(wú)規(guī)卷曲（灰色）（圖 4b），結(jié)構(gòu)多樣性利于免疫識(shí)別。經(jīng) AlphaFold2 預(yù)測(cè)并通過(guò) GalaxyRefine 優(yōu)化的三級(jí)結(jié)構(gòu)，Ramachandran 圖最適區(qū)域殘基占比從 80.1% 提升至 84.2%，Z 評(píng)分從 - 2.62 優(yōu)化至 - 2.57，表明結(jié)構(gòu)質(zhì)量顯著改善（圖 5）。

五、疫苗的免疫原性與安全性驗(yàn)證

5.1 分子對(duì)接：與免疫受體的結(jié)合能力

疫苗需通過(guò)識(shí)別宿主 Toll 樣受體（TLRs）啟動(dòng)免疫應(yīng)答。分子對(duì)接顯示，疫苗與人類 TLR4（PDB:4G8A）的結(jié)合能達(dá) - 44.566 kcal/mol，顯著高于與 TLR2（-37.928 kcal/mol）和 TLR3（-42.635 kcal/mol）的結(jié)合能力（表 4）。這一強(qiáng)相互作用表明疫苗可有效激活先天免疫，為適應(yīng)性免疫應(yīng)答奠定基礎(chǔ)。

5.2 免疫模擬：全面激活免疫應(yīng)答

通過(guò) C-ImmSim 服務(wù)器模擬三劑接種方案，結(jié)果顯示：

• 體液免疫：IgM 在初次接種后上升，IgG（包括 IgG1、IgG2）在加強(qiáng)免疫后顯著升高，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)（圖 7a）；

• 細(xì)胞免疫：輔助性 T 細(xì)胞（HTL）和細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞（CTL）數(shù)量激增，記憶細(xì)胞形成（圖 7d-e）；

• 細(xì)胞因子：γ 干擾素（IFN-γ）水平大幅上升，促進(jìn)抗胞內(nèi)病原體應(yīng)答（圖 7c）。

模擬結(jié)果與 BCG 疫苗的實(shí)際免疫應(yīng)答模式一致，證實(shí)疫苗可激發(fā)全方位免疫保護(hù)。

5.3 人群覆蓋：廣泛的 HLA 兼容性

疫苗的人群適用性取決于與人類白細(xì)胞抗原（HLA）的匹配度。對(duì)東非人群（肯尼亞、烏干達(dá)等）的分析顯示：

• I 類表位：覆蓋率 98.35%，平均每人識(shí)別 8.4 個(gè)表位；

• II 類表位：覆蓋率 100%，平均每人識(shí)別 12.26 個(gè)表位；

• 聯(lián)合覆蓋：100% 人群可被至少一種表位激活，滿足大規(guī)模接種需求（表 5、圖 9）。

這一結(jié)果表明疫苗能適應(yīng)遺傳多樣性較高的人群，具備全球推廣潛力。

六、研究意義與未來(lái)展望6.1 創(chuàng)新價(jià)值與應(yīng)用前景

該多表位疫苗的設(shè)計(jì)突破了傳統(tǒng)疫苗的局限：

• 跨物種保護(hù)：首次針對(duì)M. tuberculosis 和M. bovis 共有的保守抗原，同時(shí)應(yīng)對(duì)人類結(jié)核病和人畜共患病風(fēng)險(xiǎn)；

• 耐藥性應(yīng)對(duì)：靶標(biāo) PE_PGRS16 蛋白在耐藥菌株中高度保守，不易因突變逃逸；

• 生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)：通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，GC 含量 60.9%，密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI）接近 1，利于高效表達(dá)（圖 10）。

6.2 局限性與驗(yàn)證方向

盡管計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果樂(lè)觀，研究仍存在以下不足：

• 預(yù)測(cè)依賴生物信息學(xué)工具：AlphaFold2 對(duì)柔性蛋白區(qū)域的預(yù)測(cè)精度有限，表位加工和呈遞的復(fù)雜性未完全涵蓋；

• 缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：需通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（如 T 細(xì)胞活化、細(xì)胞因子檢測(cè)）和動(dòng)物模型（如小鼠攻毒試驗(yàn)）驗(yàn)證免疫原性和保護(hù)效力；

• 人群特異性：目前僅驗(yàn)證東非人群覆蓋度，需擴(kuò)大至全球不同種族群體。

未來(lái)研究應(yīng)優(yōu)先開(kāi)展疫苗的表達(dá)純化、安全性評(píng)估和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，逐步推進(jìn)至臨床試驗(yàn)。

七、總結(jié)

這項(xiàng)基于反向疫苗學(xué)的多表位疫苗設(shè)計(jì)，以 PE_PGRS16 蛋白為核心，整合多種免疫表位和佐劑，在生物信息學(xué)層面驗(yàn)證了其高抗原性、穩(wěn)定性和廣泛適用性。該疫苗有望填補(bǔ)現(xiàn)有疫苗在耐藥性和人畜共患病防控中的空白，為全球結(jié)核病控制提供新工具。然而，從理論設(shè)計(jì)到臨床應(yīng)用仍需克服諸多挑戰(zhàn)，期待后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究為這一創(chuàng)新方案提供堅(jiān)實(shí)證據(jù)。

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撰寫(xiě)| 生物制品圈

校稿| Gddra編審| Hide / Blue sea

編輯 設(shè)計(jì)| Alice