1 摘要

嵌合抗原受體（CAR）工程免疫細(xì)胞療法是癌癥治療的重要突破，但復(fù)雜的體外制備流程和嚴(yán)格的患者篩選限制了其廣泛應(yīng)用。體內(nèi)CAR工程具有簡化生產(chǎn)、降低成本等優(yōu)勢，正成為一種有前途的現(xiàn)成療法。臨床前研究推動了其在實體瘤等難治疾病中的應(yīng)用，并促進(jìn)了高效、持久且安全的遞送系統(tǒng)開發(fā)。本文綜述了當(dāng)前的體內(nèi)CAR工程策略，通過與傳統(tǒng)體外CAR工程技術(shù)的對比分析，深入探討了體內(nèi)CAR工程在臨床應(yīng)用中的關(guān)鍵挑戰(zhàn)，并對其未來發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

2 引言

CAR-T細(xì)胞療法作為癌癥免疫治療的重大進(jìn)展，已有7款FDA批準(zhǔn)產(chǎn)品成功用于治療多種血液腫瘤。但現(xiàn)有療法均需自體T細(xì)胞體外改造，涉及復(fù)雜個性化制備流程和高昂成本，限制了其廣泛應(yīng)用。為解決自體CAR-T的制造瓶頸，"現(xiàn)貨型"異體CAR-T產(chǎn)品展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢：即用性強(qiáng)、成本低且可標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。然而，異體CAR-T細(xì)胞存在引發(fā)致命性移植物抗宿主?。℅vHD）的風(fēng)險，仍需進(jìn)行淋巴細(xì)胞清除以預(yù)防宿主免疫排斥。因此，亟需開發(fā)兼顧療效與成本的新型CAR-T細(xì)胞工程技術(shù)。體內(nèi)CAR-T細(xì)胞療法可突破現(xiàn)有體外制備的自體和異體CAR-T細(xì)胞療法的技術(shù)瓶頸：1）作為現(xiàn)貨型療法，可簡化生產(chǎn)流程、降低成本；2）非整合載體設(shè)計可規(guī)避T細(xì)胞耗竭等安全問題；3）技術(shù)平臺已延伸至NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞研究。

圖1. 自體和異體CAR-T細(xì)胞體外治療與體內(nèi)CAR-T細(xì)胞治療的比較概述

3 體內(nèi)CAR-T細(xì)胞工程策略

當(dāng)前臨床前研究探索了多種體內(nèi)CAR-T生成技術(shù)，主要包括：負(fù)載mRNA的脂質(zhì)納米顆粒（LNP-mRNA）、封裝核酸的聚合物納米顆粒、病毒載體（慢病毒/AAV）、生物支架及新型載體（Cas9-EDVs/FuNVs）。各平臺在靶向性、系統(tǒng)風(fēng)險和基因整合安全性上各具特點，其中LNP-mRNA技術(shù)憑借疫苗成功經(jīng)驗，顯示出短暫但有效的CAR表達(dá)潛力。

3.1 LNP-設(shè)計的核酸

LNP-mRNA技術(shù)作為經(jīng)COVID-19疫苗驗證的成熟平臺，在體內(nèi)CAR-T細(xì)胞工程中展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢：其瞬時表達(dá)特性（不整合基因組）可降低毒性且無需注射前淋巴細(xì)胞清除，通過CD3/CD8等靶向抗體修飾可定向遞送至淋巴組織，顯著提升T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。臨床前研究表明，CD3靶向LNP系統(tǒng)在脾臟T細(xì)胞中實現(xiàn)劑量依賴性CAR表達(dá)，并維持90天以上的持續(xù)抗腫瘤效果，同時靶向IL-6 shRNA的共遞送可降低細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）風(fēng)險。但該技術(shù)仍面臨靶向修飾導(dǎo)致的工藝復(fù)雜、產(chǎn)品穩(wěn)定性差以及巨噬細(xì)胞脫靶轉(zhuǎn)染等挑戰(zhàn)，需通過優(yōu)化偶聯(lián)工藝和載體設(shè)計來突破當(dāng)前限制。

3.2 封裝核酸的聚合物納米顆粒

陽離子型PBAE聚合物納米顆粒通過靜電自組裝負(fù)載核酸（DNA/mRNA），具有pH響應(yīng)性內(nèi)體逃逸特性，經(jīng)肽修飾后可促進(jìn)其遺傳物質(zhì)通過微管運(yùn)輸快速進(jìn)入細(xì)胞核。該載體具有生物可降解性（體內(nèi)半衰期1-7小時）、良好耐受性和凍干穩(wěn)定性優(yōu)勢，已成功用于T細(xì)胞體內(nèi)基因工程（圖2b）及巨噬細(xì)胞離體基因工程。

將聚谷氨酸綴合至靶向CD8或CD3的抗體，并將所得綴合物靜電吸附至PBAE顆粒，可實現(xiàn)T細(xì)胞靶向遞送，在白血病、前列腺癌和乙肝相關(guān)肝癌模型中展現(xiàn)出與傳統(tǒng)CAR-T療法相當(dāng)?shù)目鼓[瘤效果。其中mRNA載體需多次給藥維持療效，而DNA載體雖可實現(xiàn)轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因組整合（已測試CD19/ROR1等靶點），但存在插入突變風(fēng)險。盡管PBAE系統(tǒng)在制備工藝和儲存成本方面優(yōu)勢顯著，但其封裝效率、長期生物相容性等指標(biāo)較LNP仍存在差距，需進(jìn)一步臨床轉(zhuǎn)化研究。

3.3 慢病毒遞送系統(tǒng)

慢病毒載體作為逆轉(zhuǎn)錄病毒亞類，通過基因組整合實現(xiàn)長效轉(zhuǎn)基因表達(dá)，已被廣泛用于將外源基因遞送至T細(xì)胞。為提高體內(nèi)靶向效率，已開發(fā)多種改造策略：（1）采用尼帕病毒/麻疹病毒等病毒囊膜假型化；（2）引入錨蛋白重復(fù)蛋白（DARPin）或scFv（如CD8/CD3靶向）增強(qiáng)T細(xì)胞趨向性（圖2c）。實驗顯示，靶向CD8的單鏈抗體慢病毒載體可在人源化NSG小鼠中使30-50% CD8+T細(xì)胞表達(dá)CAR，有效清除淋巴瘤細(xì)胞；而CD4靶向載體轉(zhuǎn)導(dǎo)率達(dá)40-60%，CD4+CAR-T細(xì)胞顯示出更高的增殖率和對CD19 + B細(xì)胞更有效的清除，這可能是由于CD8 + T細(xì)胞更敏感。

體內(nèi)直接注射T細(xì)胞靶向慢病毒可以成功地將CAR轉(zhuǎn)基因遞送到足夠數(shù)量的宿主T細(xì)胞中，從而引起治療反應(yīng)。最近，一種改良的基于慢病毒的遞送平臺在非人靈長類模型中進(jìn)行了測試。該載體在抗CD3 scFv的基礎(chǔ)上加入了共刺激配體CD80和CD58，顯著增強(qiáng)了體內(nèi)CAR-T細(xì)胞的活化和抗腫瘤功能。這些載體在體內(nèi)產(chǎn)生了CD20靶向的CAR-T細(xì)胞，該細(xì)胞占循環(huán)T細(xì)胞的65%，并導(dǎo)致長達(dá)76天的B細(xì)胞完全耗竭，表明它們在治療B細(xì)胞惡性腫瘤和B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病方面具有很好的療效。

盡管慢病毒具有成熟的離體生產(chǎn)工藝和穩(wěn)定表達(dá)優(yōu)勢，但體內(nèi)應(yīng)用仍面臨安全性挑戰(zhàn)：基因組整合的插入突變風(fēng)險、宿主免疫反應(yīng)導(dǎo)致的穩(wěn)定性問題，以及預(yù)存抗體患者的適用性限制。當(dāng)前研究證實其體內(nèi)CAR-T生成的可行性，但需要對靶向細(xì)胞類型進(jìn)行嚴(yán)格的控制，只有經(jīng)過嚴(yán)格的安全性評估后，才可考慮用于臨床試驗，以批準(zhǔn)廣泛使用。

3.4 基于AAV的遞送系統(tǒng)

腺相關(guān)病毒（AAV）是具有二十面體衣殼結(jié)構(gòu)和單鏈DNA基因組的無包膜病毒，由于其能夠?qū)崿F(xiàn)長期轉(zhuǎn)基因表達(dá)和有效的疾病表型校正，現(xiàn)已成為體內(nèi)基因治療的重要工具。與慢病毒載體相反，AAV DNA保持穩(wěn)定的附加體形式，使其成為非常適合于體內(nèi)基因操作的載體。在人源化小鼠模型中，AAV載體成功用于CD4+T細(xì)胞白血病的CAR治療，有望在未來開發(fā)HIV及其他損害CD4+T細(xì)胞的感染性疾病的療法。但需要注意的是，CAR-T細(xì)胞持續(xù)存活可能導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞耗竭，亟待開發(fā)安全開關(guān)系統(tǒng)。

3.5 生物指導(dǎo)性可植入式支架

可植入多功能藻酸鹽支架是一種介于體內(nèi)和體外策略之間的混合型CAR-T細(xì)胞工程技術(shù)。與傳統(tǒng)方法不同，這種支架能提供局部可控的微環(huán)境，增強(qiáng)了T細(xì)胞、病毒載體、細(xì)胞因子和趨化因子之間的相互作用。不僅提高了CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，還能最大限度地減少與全身T細(xì)胞工程相關(guān)的潛在系統(tǒng)副作用（圖2d）。

另一種生物可指導(dǎo)的植入式支架設(shè)計是基于膠原蛋白，將抗人CD3/CD28抗體、慢病毒和選擇的趨化因子（如CCL21、CCL3、CCL4或CXCL10等）偶聯(lián)到其中，可募集、工程化、擴(kuò)增和釋放腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs），用于實體瘤的治療。在乳腺癌人源化小鼠模型中，植入乳腺的支架能有效富集T細(xì)胞和CAR工程化，有利于CAR-T細(xì)胞在腫瘤部位的激活、擴(kuò)增和保留，并導(dǎo)致顯著的長期腫瘤消退。

總而言之，生物可植入支架技術(shù)開創(chuàng)性地將CAR-T制造與遞送整合為一體化平臺，特別適用于血液惡性腫瘤和淺表實體瘤（如黑色素瘤、乳腺癌），但在深部腫瘤（如肝癌、腦膠質(zhì)瘤等）的應(yīng)用仍面臨挑戰(zhàn)。

3.6 Cas9 --包裝包膜遞送載體

病毒載體可能導(dǎo)致非靶細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的脫靶效應(yīng)，這限制了體內(nèi)基因工程的應(yīng)用。為解決這一問題，研究人員開發(fā)了一種基于抗體-抗原特異性識別的新技術(shù)，利用靶向CD3/CD4/CD28的scFv修飾Cas9包裝遞送載體（Cas9-EDVs）（圖2e），實現(xiàn)特定細(xì)胞類型的精準(zhǔn)基因編輯。相比病毒載體，該平臺能精準(zhǔn)遞送分子貨物至特定細(xì)胞，實現(xiàn)CAR工程和基因敲除等復(fù)雜基因組修飾。但需進(jìn)一步評估其體內(nèi)抗腫瘤效果和安全性，未來研究將拓展該技術(shù)在非免疫細(xì)胞中的應(yīng)用。

3.7 病毒模擬的融合型納米囊泡

體內(nèi)直接插入預(yù)制CAR蛋白是一種創(chuàng)新的CAR-T細(xì)胞生成方法。通過靜脈注射含抗CD3 scFv和CD19 CAR的病毒模擬融合納米囊泡（FuNVs）（圖2f），可實現(xiàn)CAR蛋白在T細(xì)胞膜的瞬時表達(dá)。人源化小鼠模型證實，該方法產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞能有效清除CD19+B淋巴瘤細(xì)胞且不誘發(fā)CRS。未來通過優(yōu)化融合蛋白的特異性和效率，可最大限度地減少與脫靶相互作用相關(guān)的潛在副作用，推動臨床應(yīng)用。

圖2. 體內(nèi)T細(xì)胞CAR工程的當(dāng)前策略與機(jī)制

3.8 其他免疫細(xì)胞的體內(nèi)CAR工程

基于體內(nèi)CAR-T工程的成功經(jīng)驗，其他免疫細(xì)胞，特別是NK細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的體內(nèi)工程也被探索（圖3）。其中，CAR-巨噬細(xì)胞因其獨(dú)特的腫瘤浸潤能力和內(nèi)化特性備受關(guān)注。目前主要采用三種遞送策略：1）納米載體-水凝膠超結(jié)構(gòu)通過CD206靶向生成CAR-巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞，在膠質(zhì)瘤模型中可誘導(dǎo)長期免疫記憶；2）PBAE聚合物納米顆粒聯(lián)合RP-182肽重編程M2型巨噬細(xì)胞，在ERBB2+腦干膠質(zhì)瘤中展現(xiàn)顯著療效；3）甘露糖化載體（MPEI/MCA）通過靜脈注射實現(xiàn)全身性遞送，在胰腺癌和肝癌模型中成功激活巨噬細(xì)胞吞噬功能。此外，氧化脂質(zhì)納米粒（oLNPs）對單核細(xì)胞具有天然趨向性，可高效生成CD19 CAR-單核細(xì)胞。這些突破性進(jìn)展為實體瘤治療提供了新思路，但靜脈遞送效率仍需優(yōu)化以實現(xiàn)更廣泛的臨床應(yīng)用。除T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞外，NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞及中性粒細(xì)胞也被開發(fā)用于CAR工程化治療。然而，CAR-NK療法仍面臨持久性差、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低及需IL-15等細(xì)胞因子支持的三大技術(shù)瓶頸。

總的來說，利用T細(xì)胞以外的其他免疫細(xì)胞的體內(nèi)工程學(xué)，利用這些細(xì)胞類型的固有特性，為CAR-T細(xì)胞提供了一個很有前途的替代方案。

圖3. 臨床前模型中對巨噬細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)CAR工程的示例

3.9 超越癌癥的體內(nèi)CAR工程

CAR技術(shù)的應(yīng)用已從癌癥治療拓展至自身免疫病、感染性疾病和纖維化等非腫瘤領(lǐng)域。在自身免疫病方面，靶向CD19/BCMA/DSG3/CD20的CAR-T細(xì)胞可清除致病性B細(xì)胞，用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化等疾?。淮送猓訦IV gp120糖蛋白為靶點的CAR-T療法已進(jìn)入I/II期臨床。在纖維化治療中，CD5靶向LNP遞送FAP-CAR mRNA可使T細(xì)胞特異性識別活化成纖維細(xì)胞，小鼠模型顯示該療法能減少50%以上心臟纖維化并改善心功能。此外，CAR技術(shù)在哮喘、病毒性肝炎、COVID-19及阿爾茨海默病等領(lǐng)域都展現(xiàn)出治療潛力。

4 比較體內(nèi)和體外CAR工程

不同的CAR-T細(xì)胞制備方法，如體內(nèi)策略，使用非整合或整合載體，以及使用自體或異體細(xì)胞的體外方法，各自具有不同的優(yōu)勢，但在生產(chǎn)工藝、療效及安全性方面也面臨獨(dú)特的挑戰(zhàn)（表1）。鑒于這些平臺的多樣性，對它們進(jìn)行比較，可以深入了解它們各自的優(yōu)勢和潛在應(yīng)用。

表1. 體內(nèi)與常規(guī)體外自體CAR-T細(xì)胞工程的比較

4.1 供應(yīng)

當(dāng)前商業(yè)化及臨床試驗中對體外自體CAR-T細(xì)胞療法的需求激增，表明其生產(chǎn)能力存在很大的局限性。美國現(xiàn)有集中化生產(chǎn)模式下，周轉(zhuǎn)時間在16-33天不等，可能導(dǎo)致患者治療延誤。由于活細(xì)胞產(chǎn)品集中生產(chǎn)的復(fù)雜性，通過擴(kuò)大規(guī)模難以縮短周期，需要通過建立更加分散和本地化的制造設(shè)施來提升產(chǎn)能。但是，本地化生產(chǎn)所需要的設(shè)備試劑成本太高，并且自體CAR-T細(xì)胞療法的制造和管理成本也很高。相比之下，同種異體CAR-T細(xì)胞療法提供了一種更具成本效益的替代方案，具有更大的可擴(kuò)展性和現(xiàn)成可用的優(yōu)勢。

體內(nèi)CAR工程技術(shù)因其"現(xiàn)貨型"特性為傳統(tǒng)自體/異體CAR-T細(xì)胞療法提供了有希望的替代方案，可顯著簡化質(zhì)檢流程、優(yōu)化供應(yīng)鏈并降低成本。但新技術(shù)平臺仍存在產(chǎn)業(yè)化瓶頸。關(guān)于LNP-mRNA、PBAE聚合物-mRNA/DNA和AAV載體CAR技術(shù)在短期、中期和長期的安全性及有效性仍存在疑問，同時這些載體能否利用現(xiàn)有生產(chǎn)工藝實現(xiàn)規(guī)?；咝a(chǎn)也尚待驗證。

4.2 療效

盡管體外生成的自體CAR-T細(xì)胞療法在血液腫瘤中取得成功，但其對實體瘤的療效仍有限。新興的體內(nèi)CAR工程技術(shù)通過在腫瘤微環(huán)境（TME）中持續(xù)改造和擴(kuò)增免疫細(xì)胞，有效克服了體外CAR-T細(xì)胞持久性不足和歸巢效率低等局限。與體外療法相比，該技術(shù)具有多重優(yōu)勢：無需清淋預(yù)處理從而保護(hù)患者免疫系統(tǒng)功能；通過表位擴(kuò)散維持抗腫瘤免疫應(yīng)答；可同時或序貫靶向多個抗原降低腫瘤逃逸風(fēng)險；非整合載體實現(xiàn)CAR的瞬時表達(dá)，通過間歇給藥避免T細(xì)胞耗竭。這些特性使體內(nèi)CAR工程不僅能與現(xiàn)有療法協(xié)同克服免疫抑制性TME（圖4），還保留了患者完整的免疫功能，為實體瘤治療提供了更優(yōu)解決方案。

體內(nèi)CAR工程技術(shù)可通過遞送siRNA來實現(xiàn)基因暫時沉默，從而暫時提高T細(xì)胞的活性和持久性。然而該技術(shù)面臨多重挑戰(zhàn)：初始CAR-T細(xì)胞數(shù)量較少需體內(nèi)逐步擴(kuò)增，雖較體外制備周期短，但對免疫功能低下患者療效受限；藥代動力學(xué)參數(shù)復(fù)雜，載體和細(xì)胞分布存在很大差異；非整合載體雖可避免T細(xì)胞耗竭但表達(dá)持續(xù)時間短，而慢病毒等整合載體又存在插入突變風(fēng)險；此外，宿主體內(nèi)預(yù)存免疫可能加速載體清除，影響多次給藥效果。這些因素共同制約著體內(nèi)CAR工程的臨床應(yīng)用。

圖4. 體內(nèi)CAR工程聯(lián)合療法

4.3 安全性和毒性

與自體CAR-T療法相比，體內(nèi)CAR工程技術(shù)具有顯著安全性優(yōu)勢：無需清淋化療避免相關(guān)風(fēng)險；非整合載體實現(xiàn)劑量實時調(diào)整，可顯著降低毒性和長期副作用；基于mRNA和AAV載體的成熟安全性經(jīng)驗（經(jīng)COVID-19疫苗驗證）加速臨床轉(zhuǎn)化；納米顆粒和mRNA可以以無細(xì)胞的方式生產(chǎn)，可最大限度地減少產(chǎn)品的變異性，確保產(chǎn)品質(zhì)量均一；以mRNA和AAV為基礎(chǔ)的治療不會帶來插入突變的風(fēng)險，而體外CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)往往依賴于病毒載體的整合，如慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，這些病毒載體具有插入突變的風(fēng)險。盡管有其優(yōu)勢，但體內(nèi)CAR工程仍面臨挑戰(zhàn)：高載體劑量需求可能引發(fā)肝毒性等劑量限制性毒性；載體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)雖可能增強(qiáng)抗腫瘤免疫，但也可導(dǎo)致CRS樣癥狀。盡管慢病毒載體更穩(wěn)定和持久的CAR表達(dá)，但它們永久地整合到宿主基因組中，存在長期脫靶效應(yīng)的風(fēng)險。鑒于以上問題，目前非整合載體或位點特異性整合載體比慢病毒載體更適合用于體內(nèi)CAR工程，以提高安全性并最大限度地減少基因組破壞。

5 總結(jié)

隨著體外CAR工程的技術(shù)革新，以及不斷發(fā)展的免疫學(xué)見解，為體內(nèi)CAR工程的發(fā)展提供了重要的技術(shù)參考和理論支持。特別是近期通過優(yōu)化制備流程縮短生產(chǎn)周期、減少細(xì)胞耗竭以及增強(qiáng)記憶性和效應(yīng)功能等方面取得的研究進(jìn)展，為提升自體CAR-T細(xì)胞治療效果提供了新的技術(shù)路徑，這些成果可直接轉(zhuǎn)化應(yīng)用于體內(nèi)CAR工程的技術(shù)優(yōu)化和臨床轉(zhuǎn)化?？偟膩碚f，體內(nèi)CAR工程這一新興領(lǐng)域有望在醫(yī)療領(lǐng)域取得實質(zhì)性進(jìn)展。為了將其確立為一種新的治療模式，需要產(chǎn)學(xué)研協(xié)同攻克免疫應(yīng)答、靶向遞送等核心挑戰(zhàn)，同時在倫理規(guī)范下優(yōu)先在難治性癌癥等適應(yīng)癥開展臨床試驗。

References：

Li YR, Zhu Y, Halladay T and Yang L. Nature Reviews Immunology, 2025, May 16th, In vivo CAR engineering for immunotherapy.

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